一种有序的促进肺细胞生长的胶体晶仿生肺组织工程支架及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种有序的促进肺细胞生长的胶体晶仿生肺组织工程支架及其制备方法和应用。首先配制壳聚糖溶液和明胶溶液，将两者混合，同时加入京尼平，搅拌并超声震荡，制成凝胶；然后将四氧化三铁纳米粒子加入到凝胶中，在磁场诱导下，用胶体晶合成法制备三维多孔的胶体晶支架；最后在此支架上修饰以胶原蛋白和碱性成纤维生长因子，成功合成得到所述胶体晶仿生肺组织工程支架。此支架具有显著的促进肺细胞生长的作用，且两种生长因子共同修饰的支架促生长效果更好。此支架在肺部损伤的修复以及肺组织工程支架材料的开发方面具有很好的应用前景。

An ordered colloidal crystal biomimetic lung tissue engineering scaffold for promoting the growth of lung cells and its preparation and Application

The invention discloses an orderly colloidal crystal biomimetic lung tissue engineering scaffold for promoting the growth of lung cells, and the preparation method and application of the scaffold. The preparation of chitosan solution and gelatin solution, mixing them, adding genipin, stirring and ultrasonic vibration, made of gel; then Fe3O4 nanoparticles added to the gel, the magnetic field induced by colloidal crystal prepared by colloidal crystal porous scaffold synthesis method; finally support modified by collagen and fibroblast growth factor, successfully obtained the colloidal crystal bionic lung tissue engineering scaffold. The scaffold has a significant effect on the growth of lung cells, and the two growth factors co - modified scaffolds can promote the growth of lung cells better. The scaffold has a good application prospect in the repair of lung injury and the development of lung tissue engineering scaffold materials.

【技术实现步骤摘要】
一种有序的促进肺细胞生长的胶体晶仿生肺组织工程支架及其制备方法与应用
本专利技术属于生物医药材料
更具体地，涉及一种有序的促进肺细胞生长的胶体晶仿生肺组织工程支架及其制备方法与应用。
技术介绍
肺脏是人类重要的生命器官之一，然而肺部的各种疾病严重影响到人类健康。近年来肺癌的发病率显著地增高，在我国的工业大城市中，肺癌发病率在男性恶性肿瘤中已居首位，在女性恶性肿瘤中的发病率也居二、三位，成为危害人类健康的一种主要疾病。目前，肺癌的治疗方法是肺移植，然而这种方法存在着供体缺乏的缺陷，虽然每年的等待供体的时间在缩短，但每年肺移植的量超过3700万例，供体缺乏仍是一大限制因素。此外移植手术也存在着术后感染几率高、容易发生排斥等缺陷。近年来，肺组织工程取得了很大的研究进展，为肺部疾病的治疗提供了新的技术。然而在种子细胞的选择、支架的构建等方面仍然存在着巨大的挑战。肺种子细胞进行筛选和机能调控具有重要价值，这样利于提升组织工程生物材料的支架功能并在体外更快地进行肝脏组织的培养和重建。种子细胞的来源有很多，例如可以是自体的，可以是同种异体的或异种异体的，也可以来自于一些干细胞，其中不同的细胞源有各自不同的优点和缺点。自体细胞存在着排斥小，但也存在着取材小不易达到应有的细胞数量等局限以及其他的局限；当自体细胞供应缺乏时，异体细胞就可以作为选择作为细胞源，但异体细胞存在着排斥反应大，并且存在着将异体的病原体带入患者的风险。此外，调控肺细胞与生物材料相互作用的其中一个关键问题是生物支架材料。支架材料的选用一直是肺组织工程的一项挑战，支架材料可分为天然材料和合成材料两大类。然而不同的材料来源和不同的合成方法，支架材料的性能差异也较大，因此，目前还没有找到一种具有良好细胞适应性和良好降解性的支架，所以在支架构建这个领域存在着巨大的发展潜能。随着在支架领域的发展，肺组织工程的支架要求具备良好的生物相容性、生物可塑性、可降解性、可吸附性和多孔性等特性。有许多研究是使用的脱细胞作为肺组织工程的支架，在制备的过程中将肺细胞的细胞组分和细胞核都除去，而其中的细胞外基质被保留下来，形成一个骨架来支持细胞生长.虽然这种支架对细胞的生长有很好的促进作用，然而这种脱细胞支架在制备的过程中较为复杂。经过研究，天然生物材料或人工高分子聚合物是支架材料的主选，其中对支架修饰或改性能使其具有良好的生物学性能和生物相容性，这些修饰可为植于其上的细胞提供合适的环境因素、生长因子，形成诱导新生血管的预血管化位点或多孔结构。通过选择不同材料作为细胞培养基质，以不同结构形式承载细胞，并将各种生物活性分子固定于框架材料上，构建生物杂化系统，构建一个利于肺细胞生长分化的环境，从而达到对肺损伤部位的修复。但是，这些制备支架的方法都比较困难，应用前景很受限制。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有肺组织工程支架材料的缺陷和不足，采用一种新型的方法制备支架材料，即利用壳聚糖和明胶等天然材料，以磁性Fe3O4纳米粒子为模板，在磁场诱导下，用胶体晶合成法制备了多孔胶体晶支架，同时，在此基础上修饰以胶原蛋白、碱性成纤维生长因子，成功合成得到的支架材料能很好的促进肺细胞的生长，在肺部损伤的修复以及肺组织工程支架材料的开发方面具有很好的应用前景。本专利技术的目的是提供一种有序的促进肺细胞生长的胶体晶仿生肺组织工程支架及其制备方法。本专利技术另一目的是提供所述胶体晶仿生肺组织工程支架的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种有序的促进肺细胞生长的胶体晶仿生肺组织工程支架的制备方法，首先配制壳聚糖溶液和明胶溶液，将两者混合，同时加入京尼平，搅拌并超声震荡，制成凝胶；然后将四氧化三铁纳米粒子加入到凝胶中，在磁场诱导下，用胶体晶合成法制备三维多孔的胶体晶支架；最后在此支架上修饰以胶原蛋白和碱性成纤维生长因子，成功合成得到所述胶体晶仿生肺组织工程支架(Collagen-bFGF-CC支架)。具体地，所述胶体晶仿生肺组织工程支架的制备方法，包括如下步骤：S1.制备胶体支架配制8～420g/L的壳聚糖溶液和5～100g/L的明胶溶液，将壳聚糖溶液、明胶溶液和质量分数1～3％的京尼平混合5～10min，然后超声震荡5～10min，得凝胶；S2.制备胶体晶体多孔支架将四氧化三铁纳米粒子加入装有步骤S1凝胶的容器中，容器下方放一块磁铁，搅拌5～10min，然后超声震荡5～10min，直到四氧化三铁与凝胶充分混合，然后置于室温下自然凝固，再将凝固的样品干燥；干燥的样品用乙酸浸泡，从而溶解去除四氧化三铁纳米粒子，得到胶体晶体多孔支架；S3.对胶体晶体多孔支架进行修饰S31.将含有磺基-SMCC的DPBS注射到胶体晶体多孔支架中，放置2～4h，然后用DPBS冲洗后干燥；S32.再加入含有生长因子和胶原蛋白的DPBS，放置12～24h；最后用DPBS冲洗后干燥，得到所述胶体晶仿生肺组织工程支架。其中，优选地，步骤S1中壳聚糖溶液、明胶溶液和京尼平的体积比为1：2：0.005～0.01。优选地，步骤S1中壳聚糖溶液的配制方法为：先将体积比1：3～10的乙酸和PBS混合，然后加入壳聚糖，溶解完全得壳聚糖溶液。优选地，步骤S1中明胶溶液的配制方法为：将明胶溶于加热至90～100℃的去离子水，搅拌直到完全溶解，得明胶溶液。优选地，步骤S2所述四氧化三铁纳米粒子和凝胶的质量体积比为10～20mg：6～8mL。优选地，步骤S2所述干燥是40℃干燥48～72h。优选地，步骤S31所述含有磺基-SMCC的DPBS中，磺基-SMCC的浓度为10～20μg/ml。优选地，步骤S32所述含有生长因子和胶原蛋白的DPBS中，生长因子和胶原蛋白等量，浓度均为10～20μg/ml。优选地，步骤S3中，含有磺基-SMCC的DPBS：胶体晶体多孔支架：含有生长因子和胶原蛋白的DPBS＝20～50μl：6～8ml：40μl。优选地，步骤S31所述干燥是40～60℃下干燥24～48h。优选地，步骤S32所述干燥是40～60℃下干燥12～24h。另外，由上述方法制备得到的能够促进肺细胞生长的胶体晶仿生肺组织工程支架，以及该支架在制备肺组织工程支架材料方面的应用，都应在本专利技术的保护范围之内。支架材料是组织工程关键因素之一。目前对支架的材料选择，制备方法的研究有很多，但本专利技术倾向于用天然的材料来制备毒性小的支架。本专利技术选择低成本的天然材料壳聚糖和明胶为原料，壳聚糖为碱性多糖，明胶是胶原的变性产物，二者均具有良好的生物相容性，用胶体晶合成法制备肺组织工程仿生支架，在此基础上用Fe3O4纳米粒子作为制孔剂，选择Fe3O4的意图在于它带有磁性，可以利用这一点加磁场来控制Fe3O4的排布从而制备出空隙不一的多孔支架，这也是本专利技术研究的创新点之一；此外Fe3O4无毒，对细胞不会产生毒副作用。本专利技术对制备的支架做了一系列的表征工作，在此过程中也发现了不少问题。制备好支架后需要想办法将Fe3O4去除从而留下空隙，我们用弱酸来溶解Fe3O4，产物产生的铁盐无毒，对细胞影响不大，但是干燥之后发现制备的空隙很不均匀，其原因可能是用冷冻干燥机进行了干燥，在此干燥过程中，有一定的压力对形成的孔隙造成了一定的影响，导致形成的凸起和孔隙的排布不规则。为了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种有序的促进肺细胞生长的胶体晶仿生肺组织工程支架的制备方法，其特征在于，首先配制壳聚糖溶液和明胶溶液，将两者混合，同时加入京尼平，搅拌并超声震荡，制成凝胶；然后将四氧化三铁纳米粒子加入到凝胶中，在磁场诱导下，用胶体晶合成法制备三维多孔的胶体晶支架；最后在此支架上修饰以胶原蛋白和碱性成纤维生长因子，成功合成得到所述胶体晶仿生肺组织工程支架。

【技术特征摘要】
1.一种有序的促进肺细胞生长的胶体晶仿生肺组织工程支架的制备方法，其特征在于，首先配制壳聚糖溶液和明胶溶液，将两者混合，同时加入京尼平，搅拌并超声震荡，制成凝胶；然后将四氧化三铁纳米粒子加入到凝胶中，在磁场诱导下，用胶体晶合成法制备三维多孔的胶体晶支架；最后在此支架上修饰以胶原蛋白和碱性成纤维生长因子，成功合成得到所述胶体晶仿生肺组织工程支架。2.根据权利要求1所述胶体晶仿生肺组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.制备胶体支架配制8～420g/L的壳聚糖溶液和5～100g/L的明胶溶液，将壳聚糖溶液、明胶溶液和质量分数1～3%的京尼平混合5～10min，然后超声震荡5～10min，得凝胶；S2.制备胶体晶体多孔支架将四氧化三铁纳米粒子加入装有步骤S1凝胶的容器中，容器下方放一块磁铁，搅拌5～10min，然后超声震荡5～10min，直到四氧化三铁与凝胶充分混合，然后置于室温下自然凝固，再将凝固的样品干燥；干燥的样品用乙酸浸泡去除四氧化三铁纳米粒子，得到胶体晶体多孔支架；S3.对胶体晶体多孔支架进行修饰S31.将含有磺基-SMCC的DPBS注射到胶体晶体多孔支架中，放置2～4h，然后用DPBS冲洗后干燥；S32.再加入含有生长因子和胶原蛋白的DPBS，放置12～24h；最后用DPBS冲洗后干燥，得到所述胶体晶仿生肺组...

【专利技术属性】
技术研发人员：关燕清，班晴，陈吾雅，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东,44