一种过氧化氢响应的比率计纳米探针及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种过氧化氢响应的比率计纳米探针及其应用，所述探针包括过氧化氢响应的荧光分子，过氧化氢惰性的荧光分子和生物相容性良好的聚合物。本发明专利技术还公开过氧化氢响应的比率计纳米探针在制备恶性实体瘤外周血循环肿瘤细胞检测剂中的应用。本发明专利技术提供的比率计纳米探针具有良好的水溶性，易被细胞摄取且细胞毒性低，用于循环肿瘤细胞中的过氧化氢的定量成像。该比率计纳米探针具有优异的荧光性能，对过氧化氢具有很好的灵敏性和特异性，可以检测不同恶性实体瘤细胞中过氧化氢水平的差异和细胞内摄量的不同。

A ratio meter probe and its application for the response of hydrogen peroxide

The invention discloses a hydrogen peroxide responsive ratio meter nano probe and its application. The probe comprises a hydrogen peroxide responsive fluorescent molecule, an inert hydrogen peroxide fluorescent molecule and a biocompatible polymer. The present invention also discloses the application of the ratio meter probe of hydrogen peroxide response in the preparation of malignant solid tumor peripheral blood circulating tumor cell detection agent. The ratiometric nano probe provided by the invention has good water solubility, easy to be absorbed by cells and low cytotoxicity, and is used for quantitative imaging of hydrogen peroxide in circulating tumor cells. This ratio probe has excellent fluorescence performance and has good sensitivity and specificity to hydrogen peroxide. It can detect the difference of hydrogen peroxide level and the difference of intracellular uptake in different malignant solid tumor cells.

【技术实现步骤摘要】
一种过氧化氢响应的比率计纳米探针及其应用
本专利技术属于生物领域，更具体地讲，涉及一种过氧化氢响应的比率计纳米探针及其在检测外周血循环肿瘤细胞中的应用。
技术介绍
循环肿瘤细胞(CTC)是从原发肿瘤脱落下来进入外周血循环的具有特殊性质的肿瘤细胞。在临床上癌症的诊断和治疗中，CTC被认为是一种具有肿瘤诊断特性的生物标志物。因而，对CTC的捕获和分析在对癌症病人的生物学分类，采取具体的治疗方法，监测疗效等方面有着很大的应用前景。然而，由于CTC在外周血中的数量极少，对CTC的计数和鉴定存在很大的挑战。目前检测人外周血中的“循环肿瘤细胞”方法很多，有根据肿瘤细胞大小、弹性等物理特性检测的方法；也有根据肿瘤细胞表面特异性抗原来检测的；或检测肿瘤细胞内多倍染色体的方法。由于肿瘤细胞的异源性，其在大小、弹性等物理特性上可不一致；同样的原因，其表达的特异性抗原也可丢失或减少表达。因此，现有的检测方法在灵敏度或特异性上有一定程度的不足。相比于正常细胞，肿瘤细胞通常代谢旺盛且具有高的细胞内过氧化氢(H2O2)水平。而CTC作为一种特殊的肿瘤细胞具有此相同的特征。因此，我们把高的细胞内过氧化氢水平作为CTC的另一个特点用于CTC的鉴定，从而克服上述提到的方法的缺点。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种适用于循环肿瘤细胞鉴定的过氧化氢响应的比率计纳米探针。本专利技术的第二个目的在于提供一种过氧化氢响应的比率计纳米探针的制备方法。本专利技术的第三个目的在于提供一种过氧化氢响应的比率计纳米探针在制备恶性实体瘤外周血循环肿瘤细胞检测剂中的应用。为实现本专利技术第一个目的，本专利技术公开以下技术方案：一种过氧化氢响应的比率计纳米探针，其特征在于，所述探针包括过氧化氢响应的荧光分子，过氧化氢惰性的荧光分子和生物相容性良好的聚合物。作为一个优选方案，所述过氧化氢响应的荧光分子包括香豆素-苯硼酸频哪醇酯。作为一个优选方案，所述过氧化氢惰性的荧光分子是指以发红光为代表的发射波长在580-680nm的小分子荧光分子。作为一个优选方案，所述过氧化氢惰性的荧光分子包括罗丹明B、PE、Cy系列染料及水溶性碳点。作为一个优选方案，所述生物相容性良好的聚合物包括含氨基或羧基的聚合物。作为一个优选方案，所述含氨基或羧基的聚合物包括氨基修饰的壳聚糖和羧酸修饰的聚乙烯醇。为实现本专利技术第二个目的，本专利技术公开以下技术方案：一种过氧化氢响应的比率计纳米探针的制备方法，其特征在于，将过氧化氢响应的荧光分子和过氧化氢惰性的荧光分子接枝到生物相容性良好的聚合物上，得到具有两亲性特征的聚合物，在水中自组装形成过氧化氢响应的比率计纳米探针。为实现本专利技术第三个目的，本专利技术公开以下技术方案：一种过氧化氢响应的比率计纳米探针在制备恶性实体瘤外周血循环肿瘤细胞检测试剂盒中的应用。作为一个优选方案，所述恶性实体瘤包括胃癌、肺癌、结肠癌、肝癌、喉癌、食管癌、膀胱癌、口咽癌、乳腺癌、前列腺癌。本专利技术的优点在于：本专利技术提供的比率计纳米探针具有良好的水溶性，易被细胞摄取且细胞毒性低，用于循环肿瘤细胞中的过氧化氢的定量成像。该比率计纳米探针具有优异的荧光性能，对过氧化氢具有很好的灵敏性和特异性，可以检测不同恶性实体瘤细胞中过氧化氢水平的差异和细胞内摄量的不同。附图说明图1为比率计过氧化氢纳米探针。图2为核磁共振谱仪测定的比率计纳米探针的化学结构表征。图2(a)1HNMR谱图所示，6.5-8.0ppm处出现了两个荧光分子苯环的特征峰，且1.3ppm处出现了苯硼酸频哪醇酯上甲基的特征峰，表明Cou-Bpin和RhB成功地接枝到GC上，制备得到共价聚合物GC-Cou-Bpin-RhB。图2(b)DLS测得GC-Cou-Bpin-RhB纳米探针的平均粒径为200nm左右，TEM测得其粒径约为150nm左右。图2(c)GC-Cou-Bpin-RhB比率计纳米探针未和H2O2反应时，Cou的最大紫外吸收峰在350ppm,和H2O2反应后红移到了400nm,而RhB的最大紫外吸收峰在和H2O2反应后都在560nm，不受影响。图2(d)在0-200μM的浓度范围内，比率计纳米探针Cou对H2O2具有很好的响应性，随着H2O2浓度的增加，荧光强度逐渐增强，且在反应30min内具有很好的线性关系，而内标探针RhB的荧光强度在不同的H2O2浓度和不同的反应时间都基本保持不变。图3为比率计过氧化氢纳米探针测定的正常细胞株(HEK293[(a),(b)],NIH-3T3[(c),(d))和结肠癌细胞株(HCT116[(e),(f)],HT29[(g),(h)],SW620[(i),(j))的流式细胞仪测定结果。在正常细胞株(3(a),3(c))内过氧化氢纳米探针的Cou-Bpin在30min内即和细胞内完成过氧化氢反应，其浓度随时间变化不大，而在结肠癌细胞株内(3(e),3(g),3(i))Cou-Bpin浓度随时间增加；在正常细胞株3(b),3(d)和结肠癌细胞株(3(e),3(g),3(i))内过氧化氢纳米探针的RhB浓度随时间增加，表明随探针进入细胞的量随时间增加。图4为比率计过氧化氢纳米探针测定正常细胞株HEK293,NIH-3T3和结肠癌肿瘤细胞株HCT116,HT29及SW620细胞内Cou-Bpin(蓝光)和RhB(红光)的荧光强度变化。图5为不同时间点内(i)0h,(ii)30min,(iii)60min,and(iv)120min.比率计过氧化氢纳米探针测定正常细胞株(HEK293,NIH-3T3)和结肠癌细胞株(HCT116,HT29，SW620)细胞内过氧化氢的激光共聚焦图。图6为结直肠癌病人外周血中的循环肿瘤细胞的激光共聚焦图，比率计过氧化氢纳米探针检测出循环肿瘤细胞，蓝色荧光为探针内Cou-Bpin与过氧化氢反应后产生的；红光为探针中的过氧化氢惰性的荧光分子内标(RhB)；绿色荧光为FITC标记CK19抗体。Merge为同一细胞中蓝光、红光和绿光重叠后的图像，荧光的完全重叠表明这些不同颜色的荧光来自同一细胞；Brightfield为显微镜白光下观察的细胞图像。图7为胃癌病人外周血中的循环肿瘤细胞的激光共聚焦图。比率计过氧化氢纳米探针检测出循环肿瘤细胞。绿色荧光为FITC标记CK19抗体。图8为肺癌病人外周血中的循环肿瘤细胞的激光共聚焦图。比率计过氧化氢纳米探针检测出循环肿瘤细胞。绿色荧光为FITC标记CK19抗体。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例1.比率计纳米探针的合成、组装及表征将琥珀酰亚胺活化的-香豆素-苯硼酸频哪醇酯(62.6mg,0.125mmol)和异硫氰酸酯活化的罗丹明B(6.65mg,0.0125mmol)分别溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，逐滴加入到乙二醇壳聚糖(160mg,0.75mmol)的水溶液中，最后加入20μL的三乙胺，室温反应24h。反应结束后先在DMSO/H2O(1/4,V/V)中透析48h，再在超纯水中透析48h，组装得到比率计纳米探针(GC-Cou-Bpi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种过氧化氢响应的比率计纳米探针，其特征在于，所述探针包括过氧化氢响应的荧光分子，过氧化氢惰性的荧光分子和生物相容性良好的聚合物。

【技术特征摘要】
1.一种过氧化氢响应的比率计纳米探针，其特征在于，所述探针包括过氧化氢响应的荧光分子，过氧化氢惰性的荧光分子和生物相容性良好的聚合物。2.根据权利要求1所述的一种过氧化氢响应的比率计纳米探针，其特征在于，所述过氧化氢响应的荧光分子包括香豆素-苯硼酸频哪醇酯。3.根据权利要求1所述的一种过氧化氢响应的比率计纳米探针，其特征在于，所述过氧化氢惰性的荧光分子是指以发红光为代表的发射波长在580-680nm的小分子荧光分子。4.根据权利要求3所述的一种过氧化氢响应的比率计纳米探针，其特征在于，所述过氧化氢惰性的荧光分子包括罗丹明B、PE、Cy系列染料及水溶性碳点。5.根据权利要求1所述的一种过氧化氢响应的比率计纳米探针，其特征在于，所述生物相容...

【专利技术属性】
技术研发人员：李培勇，李纯婷，朱新远，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属瑞金医院，
类型：发明
国别省市：上海,31