含内源性多肽的人参提取物及其制备和测定、含人参提取物的药物或药物组合物及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种含内源性多肽的人参提取物的制备方法以及人参提取物、人参提取物中多肽的测定方法，含有人参提取物的药物或药物组合物及其应用。本发明专利技术所述的制备方法是将人参药材磨粉，再经有机溶剂或甲酸提取，提取液经柱分离，洗脱液浓缩即可获得以内源性人参多肽为主要成分的人参提取物。所述的人参提取物的测定方法是利用Nano LC‑LTQ‑Orbitrap技术进行分析，通过PEAKS搜索Swiss‑Prot数据库，共从人参提取物中鉴定308个内源性多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1‑125以及SEQ ID NoS.1‑183，分子量范围300～7000Da。经UHPLC‑Q‑TOF检测，Progenesis QI软件分析该提取物人参多肽含量大于30％。本发明专利技术还对此人参提取物进行了细胞实验，实验结果表明，该提取物对PC12细胞具有促增殖作用。

Ginseng extract containing endogenous polypeptide and its preparation and determination, drug or pharmaceutical composition containing ginseng extract and its application

The invention provides a preparation method of ginseng extract containing endogenous polypeptide, a method for determining polypeptide in ginseng extract and ginseng extract, a medicine or medicine composition containing ginseng extract and its application. The preparation method of the invention is to extract ginseng powder and extract it by organic solvent or formic acid, and extract liquid is separated by column separation and concentrated by eluent, and then ginseng extract with endogenous ginseng polypeptide as main component can be obtained. The determination method of ginseng extract was analyzed by Nano LC LTQ Orbitrap technology, Swiss search database through Prot PEAKS, a total of from ginseng extract identification of 308 endogenous peptides, amino acid sequence of the polypeptide SEQ ID No.1 125 and SEQ NoS.1 183 ID, molecular the amount of the range of 300 ~ 7000Da. The UHPLC Q TOF detection, Progenesis QI analysis software the extract of ginseng polypeptide content more than 30%. The present invention also carries out the cell experiment of the ginseng extract, and the experimental results show that the extract can promote the proliferation of PC12 cells.

【技术实现步骤摘要】
含内源性多肽的人参提取物及其制备和测定、含人参提取物的药物或药物组合物及其应用
本专利技术属于天然药物领域。具体涉及一种含内源性多肽的人参提取物的制备方法以及人参提取物、人参提取物中多肽的测定方法，含有人参提取物的药物或药物组合物及其应用，所述多肽来源于人参提取物且为内源性多肽。
技术介绍
随着现代社会经济的飞速发展，人们在学习和工作中所承受的压力日益增大，成为一个不容忽视的健康问题，它可引起焦虑、失眠、抑郁等，最终导致记忆力下降，工作效率降低。另外，在正常生理状态下，伴随年龄增长和机体衰老，也会出现学习记忆能力减退。因此开发具有神经保护作用或改善学习记忆功能的保健品是十分必要的。中药人参为五加科植物人参(PanaxginsengC.A.Mey)的干燥根和根茎。安神益智，复脉固脱，补脾益肺，生津止渴，在中国具有悠久的药用历史。在我国，人参主产于东北三省，以吉林长白山、敦化一代产量最高，其主要成分为皂苷、多肽、多糖及挥发油等。研究表明，人参具有兴奋与抑制中枢神经系统，改善学习记忆，增强机体应激能力，提高机体免疫力等作用(路放等,人参研究,2013(01):46-52；曹智等,人参研究,2012(02):39-43.)。近年来，随着分子生物学、生物化学等学科的发展，人们对生物活性肽的研究日趋广泛，各种具有不同生理活性的动物或植物多肽被提取出来，或开发成相关产品。人参蛋白多肽的研究始于20世纪60年代，但受到分离技术及分析、测序等手段的限制，从人参中分离并测定准确氨基酸序列的多肽数量相当有限，制备方面，多数研究是通过酶解等手段得到人参蛋白的酶解产物，因此采用先进的质谱分析技术及蛋白质组学质谱数据分析软件对人参中内源性多肽进行分析并从人参中制备富含人参多肽的部位具有深远的科学价值和很好的应用前景。PC12细胞为大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤分化的细胞株，是一种儿茶酚胺细胞，能合成贮存并释放适量的儿茶酚胺(主要是多巴胺和去甲肾上腺素)，具有典型的神经细胞特征，是常用于体外研究神经性疾病的细胞模型，筛选具有神经保护作用的中药活性成分。
技术实现思路
本专利技术提供了一种含多肽的人参提取物的制备方法以及人参提取物、人参提取物中多肽的测定方法，含有人参提取物的药物或药物组合物及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种含多肽的人参提取物的制备方法，将人参磨粉，再经有机溶剂或甲酸提取，提取液经柱分离，洗脱液减压浓缩即可获得以内源性人参多肽为主要成分的人参提取物；具体步骤如下：1)溶剂提取人参磨粉后，用有机溶剂或甲酸浸泡0.5-1.5小时，超声提取30-60分钟，离心后收集上清液；2)柱分离将上述上清液经柱分离，以体积分数为0％～20％的有机溶剂洗脱除杂，再以体积分数为20％～70％的洗脱液进行洗脱，收集体积分数为20％～70％的洗脱液，浓缩干燥得人参提取物。步骤1)中所述的有机溶剂选自体积分数为40％～60％的甲醇、乙醇、乙腈或丙酮中的一种或两种以上，其余为水，所述甲酸的体积分数为70～90％，其余为水，人参与有机溶剂或甲酸体积的质量体积比为1g:10-20mL；浓缩干燥后体积为原体积的5％～15％。步骤2)中柱分离采用反相C18柱、MCI柱或大孔吸附树脂柱HPD100中的一种；步骤2)中所述洗脱除杂的有机溶剂选自体积分数为0％～20％的乙腈、甲醇或乙醇中的一种(有机溶剂为0％时,直接用水进行洗脱除杂)；所述洗脱液选自体积分数为20％～70％的乙腈、甲醇或乙醇中的一种；洗脱体积为2～3倍柱体积。步骤2)中C18柱分离的操作条件为：将除杂后的上清液浓缩后过C18柱，洗脱液以体积分数计，以2倍柱体积10％、30％、40％、50％、70％、90％乙腈洗脱，流速0.5mL/min，收集40％乙腈洗脱液，浓缩干燥得人参提取物；步骤2)中HPD100树脂柱分离的操作条件为：将除杂后的上清液浓缩后经HPD100树脂柱，洗脱液以体积分数计，以2倍柱体积10％、30％、50％、70％、90％乙醇洗脱，流速0.5mL/min，收集50％乙醇洗脱液，浓缩干燥得人参提取物；步骤2)中MCI柱分离的操作条件为：将除杂后的上清液浓缩后经MCI(CHP20/P120)柱，以10倍柱体积的水洗脱除去酸，洗脱液以体积分数计，然后以2倍柱体积10％、30％、40％、50％、70％、90％和100％甲醇洗脱，流速0.5mL/min，收集40％甲醇洗脱液，浓缩干燥得人参提取物。一种上述制备方法获得的人参提取物，所述人参提取物含人参内源性多肽，所述多肽的氨基酸序列包括SEQIDNo.1-125以及SEQIDNoS.1-183。经UHPLC-Q-TOF测定人参提取物中多肽成分的含量大于30％，分子量范围300～7000Da。本专利技术利用NanoLC-LTQ-Orbitrap技术进行分析，借助ProgenesisQI软件测定人参提取物中的多肽成分及含量，进一步进行二级质谱分析，通过PEAKS搜索Swiss-Prot数据库，从人参提取物中鉴定出308个内源性多肽，用PEAKSDB、PEAKSPTM两种方式对人参多肽进行分析测序。具体操作为：1)分析：均以体积分数计，将权利要求1得到的人参提取物用0.1％甲酸溶解，NanoLC-LTQ-Orbitrap仪器进行分析，通过注射泵注射8μL样品到捕获柱(150μmID，3cm，ReproSil-PurC18AQ)中，用含0.2％甲酸和2％乙腈的水溶液洗脱3分钟后切换到分析柱(75μmID，ReproSil-PurC18AQ)进行分析，流动相A：0.2％甲酸，流动相B：含0.2％甲酸和95％乙腈的水溶液，梯度洗脱流程：0-3.5分钟，5％B；3.5-6分钟，10％-20％B；6-35分钟，20％-50％B；35-40分钟，50％-90％B；40-45分钟，90％B；2)多肽测序分析：将原始数据导入蛋白组学质谱软件PeaksStudio7(BSI)，分别用PEAKSDB和PEAKSPTM两种模式进行序列分析，数据的过滤阈值为数据品质值>0.3，处理后的数据进行自动从头测序，母离子及子离子的质量误差分别设为10ppm和0.05Da，裂解不指定酶的参与，指定C-端酰胺化、N-端乙酰化以及谷氨酸和谷氨酰胺的环化(pyroglutamalytion)等常见翻译后修饰，以Swiss-Prot中全部蛋白质为数据库进行数据检索，搜索鉴定的假阳性率(FDR)<1％，对搜索得到的肽序列，结合其可信度(-10logP)、肽链断裂情况、子离子的分配情况、及误差范围逐个进行人工分析确认，最终从搜索到的近两千个序列中鉴定出308个高可信度多肽，多肽的氨基酸序列为SEQIDNo.1-125以及SEQIDNoS.1-183。一种以含有所述人参提取物为活性成分的药物或以含有以人参提取物为活性成分与其它药学上可接受的载体和/或赋形剂组成的药物组合物。一种所述药物或药物组合物在神经保护作用和/或改善学习记忆功能和/或PC12经UHPLC-Q-TOF测定细胞促增殖中的应用。本专利技术所用的溶液除溶质外，溶剂均为水，且含量均为体积分数。以本专利技术所制备的人参提取物与文献对比有以下优点及进步：调研相关文献，对人参多肽的制备主要有两种方法：一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含内源性多肽的人参提取物的制备方法,其特征在于:将人参磨粉，再经有机溶剂或甲酸提取，提取液经柱分离，洗脱液减压浓缩即可获得以内源性人参多肽为主要成分的人参提取物；具体步骤如下：1)溶剂提取人参磨粉后，用有机溶剂或甲酸浸泡0.5‑1.5小时，超声提取30‑60分钟，离心后收集上清液；2)柱分离将上述上清液经柱分离，以体积分数为0％～20％的有机溶剂洗脱除杂，再以体积分数为20％～70％的洗脱液进行洗脱，收集体积分数为20％～70％的洗脱液，浓缩干燥得人参提取物。

【技术特征摘要】
1.一种含内源性多肽的人参提取物的制备方法,其特征在于:将人参磨粉，再经有机溶剂或甲酸提取，提取液经柱分离，洗脱液减压浓缩即可获得以内源性人参多肽为主要成分的人参提取物；具体步骤如下：1)溶剂提取人参磨粉后，用有机溶剂或甲酸浸泡0.5-1.5小时，超声提取30-60分钟，离心后收集上清液；2)柱分离将上述上清液经柱分离，以体积分数为0％～20％的有机溶剂洗脱除杂，再以体积分数为20％～70％的洗脱液进行洗脱，收集体积分数为20％～70％的洗脱液，浓缩干燥得人参提取物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤1)中所述的有机溶剂选自体积分数为40％～60％的甲醇、乙醇、乙腈或丙酮中的一种或两种以上，所述甲酸的体积分数为70～90％，人参与有机溶剂或甲酸体的质量体积比为1g:10-20mL，浓缩干燥后体积为原体积的5％～15％。步骤2)中柱分离采用反相C18柱、MCI柱或大孔吸附树脂柱HPD100中的一种；步骤2)中所述洗脱除杂的有机溶剂选自体积分数为0％～20％的乙腈、甲醇或乙醇中的一种(有机溶剂为0％时,直接用水进行洗脱除杂)；所述洗脱液选自体积分数为20％～70％的乙腈、甲醇或乙醇中的一种；洗脱体积为2～3倍柱体积。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤2)中C18柱分离的操作条件为：将除杂后的上清液浓缩后过C18柱，洗脱液以体积分数计，以2倍柱体积10％、30％、40％、50％、70％、90％乙腈洗脱，流速0.5mL/min，收集40％乙腈洗脱液，浓缩干燥得人参提取物；步骤2)中HPD100树脂柱分离的操作条件为：将除杂后的上清液浓缩后经HPD100树脂柱，洗脱液以体积分数计，以2倍柱体积10％、30％、50％、70％、90％乙醇洗脱，流速0.5mL/min，收集50％乙醇洗脱液，浓缩干燥得人参提取物；步骤2)中MCI柱分离的操作条件为：将除杂后的上清液浓缩后经MCI(CHP20/P120)柱，以10倍柱体积的水洗脱除去酸，洗脱液以体积分数计，以2倍柱体积10％、30％、40％、50％、70％、90％和100％甲醇洗脱，流速0.5mL/min，收集40％甲醇洗脱液，浓缩干燥得人参提取物。4.一种权利要求1所述制备方法获得的人参提取物，其特征在于：所述人参提取物含人参内源性多肽，所述多肽的氨基酸序列包括SEQIDNo.1-125以及SEQIDNoS.1-183。5.一种权利要求1所述制备方法获得的人参提取物，其特征在于：经UHPLC-Q-TOF测...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓哲，刘欣欣，程孟春，赵楠，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21