一种苹果腐烂病病原菌快速接菌及致病力快速鉴定的方法技术

本发明专利技术涉及一种苹果腐烂病病原菌快速接菌及致病力快速鉴定的方法，该方法是将苹果枝条和叶片用划布轮划伤，取苹果腐烂病菌黑腐皮壳菌

Rapid identification of pathogenic bacteria of Apple rot disease and rapid identification of pathogenicity

The invention relates to a method of Apple rot disease pathogen rapid inoculation and pathogenicity identification, this method is the apple leaves and branches with paddle wheel from scratch, the pathogen of black rot botryobasidiaceae

【技术实现步骤摘要】
一种苹果腐烂病病原菌快速接菌及致病力快速鉴定的方法
本专利技术涉及一种苹果腐烂病病原菌快速接菌以及致病力快速鉴定的方法，属于生物

技术介绍
苹果树腐烂病(appletreeValsacanker)是由苹果黑腐皮壳(Valsamali)引起的枝干皮层腐烂病害，据报道V.mali属于子囊菌门，黑腐皮壳科，黑腐皮壳属。自然条件下常表现有枝枯型和溃疡型两种症状，前者常见于小枝上，引起纸条顶端枯死形成枯梢；而溃疡型病斑常见于主干及侧枝上，引起树皮腐烂。病斑部位常隆起，水渍状，有酒糟味，后期病部干瘪、塌陷，呈黑褐色，其上着黑色小点为病菌的分生孢子器，在雨水充足或高湿的条件下，会分泌出黄色卷须状的分生孢子角，分生孢子经雨水和气流传播造成危害。其病原菌可以侵染苹果树的主枝、主干和果实等多个部位，轻者造成主枝、主干枯死，使果树结果量和结果年限锐减，影响苹果的产量和质量；重者全株枯死，甚至全园毁灭，已成为影响苹果生产的主要制约因素之一。苹果(MalusdomesticaBorkh.)是世界四大水果之一，我国的苹果生产、加工和出口规模目前均已处于世界领先地位。2011年中国苹果的总产量已超过世界总量的50％，出口103万吨，中国对世界苹果增产的贡献率超过100％，已经逐步成为世界苹果发展的驱动力。陕西、甘肃、山东、辽宁、河南、北京、河北、云南、山西、江苏省10个省市是我国苹果的优势产区，苹果栽培面积和产量均占全国的90％以上，然而，苹果树腐烂病的严重发生，10个省市苹果腐烂病的发病情况属河南省发病株率最高，为85.1％，山西省最低为19.5％，其他省份变动在30％-60％之间(曹克强,国立耘etal.2009)，直接严重影响和制约了苹果产量和品质的提高，从而制约了我国农业产业经济发展。除了栽培苹果，苹果腐烂病也侵染新疆野苹果(Malussieviersii,又名塞威士苹果)，并造成严重的生态灾难。新疆野苹果，分布于天山山脉，包括中国新疆伊犁地区和中亚五国。在我国，新疆野苹果集中分布在新疆伊犁的巩留、新源、霍城和裕民等地。在中亚，新疆野苹果分布在哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、乌兹别克斯坦、塔吉克斯坦和土库曼斯坦共和国。新疆野苹果种质资源丰富，具有很高的遗传多样性，挖掘利用的潜力很大，不仅是我国新疆天山野果林区中珍贵的第三纪孑遗植物，也是我国经济林资源中唯一天然的基因库，更是世界野苹果基因库的重要组成部分，且研究证明新疆野苹果是现代栽培苹果(MalusdomesticsBorkh.)的祖先，具有很重要的科研和保护价值(Daccordetal.2016,Duanetal.2017)。然而由于种种原因，近十年来，新疆野苹果林遭受了毁灭性的生态危害，大面积的野苹果纯林衰败甚至死亡。据调查，1959年野苹果林面积达9300hm2，随着病虫害以及人为活动影响，2006年面积仅为5000hm2。苹果腐烂病是一种弱寄生病菌。野果林遭受强烈人为干扰以及小吉丁虫(AgrilusmaliMats.)虫害大面积集中爆发，导致野果林大面积衰败；羸弱植株进一步被游离的腐烂病孢子侵染，进一步爆发弱寄生所导致的腐烂病，成为野苹果林大面积死亡的最后推手。因此，为了进一步有效保护天山野果林，加快新疆野苹果腐烂病机理研究，有效进行腐烂病防治，我们需要一个快速、高效的苹果树腐烂病接菌及致病力鉴定的方法。然而目前，尚缺乏这样一套高效成熟的、简便易行的尤其适合野外操作的方法体系。目前苹果腐烂病鉴定方法主要是烙铁烫伤树枝接菌法和针刺叶片接菌法，其主要特征是：用灼烧过的烙铁或电烙铁，将树表皮烫伤，形成烫伤伤口，再将培养3天的菌饼贴在烫伤处，保湿处理。发病后8-10天，观察并统计病斑长度。叶片则采用注射器针头刺伤叶表面，刺伤处理一般为10-20下，再将菌饼贴合在刺伤伤口处，保湿处理。发病后3-4天观察并统计病斑面积。这两种方法都是通过对树枝和叶片表皮造成伤害，使腐烂病菌侵入植物组织内部，达到接菌目的。烙铁烫伤树枝的方法对植物本身具有很大伤害，处理过程耗时长，重复之间不能保证烙铁烫伤温度一致，从而导致较大误差，烫伤过程操作繁琐，更不便于在野外操作；烙铁烫伤不能用于叶片处理，虽用注射器针刺代替，但针刺操作易受个人操作因素影响产生大小不均一的伤口，从而导致误差，且刺伤效率低，耗时耗力，不便于大批量树干或叶片接菌。因此，需要研制一种简便易行、准确高效的、尤其适用于野外大样本量处理的苹果树腐烂病接菌及致病力鉴定的方法。本专利技术使用划布轮刺伤苹果枝条与叶片，不仅可以对苹果枝条和叶片表面造成整齐均一的伤口，便于病原菌侵入植物组织内部，而且对植物的伤害远低于烫伤和刺伤。同时，建立了一整套从病菌培养-接菌处理-病斑观察-致病力鉴定的方法体系，高效准确、简单易行。本专利技术适用于包括栽培苹果、新疆野苹果、栽培海棠(Malusspectabilis)在内的仁果类经济果木腐烂病菌快速接菌、腐烂病致病力快速鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供一种苹果腐烂病病原菌快速接菌和苹果树致病力快速鉴定的方法，该方法是先用酒精对枝干和叶片进行表面消毒，再用灭菌蒸馏水冲洗后，用无菌脱脂棉球将表面水分擦干；再用已灭菌的划布轮均匀的用力刺伤枝干表皮和叶表面，形成一行或多行刺伤小孔；把准备好的菌饼贴放在刺伤小孔上，使长菌一面完全贴合刺伤小孔，再用脱脂棉球包裹枝干，在其上方悬空滴加800μl灭菌水，用封口膜将其包裹保湿。本专利技术所述方法可以使苹果腐烂病菌在苹果枝干和叶片迅速发病，快速鉴定苹果树腐烂病致病力，为野苹果腐烂病发病机理研究和抗病基因挖掘相关研究奠定基础。本专利技术所述方法简单、快速、积极有效，获得的枝干和叶片发病情况良好，并适用于田间试验，是一种快速稳定高效的鉴定方法。本专利技术所述的一种苹果腐烂病病原菌快速接菌及致病力快速鉴定的方法，按下列步骤进行：苹果腐烂病病原菌的培养：a、采用PDA平板培养腐烂病病原菌，用直径5mm打孔器在黑腐皮壳菌Valsamali03-8的菌落边缘打孔，所取下来的菌饼接种在PDA平板的中央，温度25℃暗培养3天待用，其中所用菌株黑腐皮壳菌Valsamali03-8为腐烂病的强致病力菌株；枝条接菌处理：b、选取健康的新疆野苹果、栽培苹果或栽培海棠枝条，截成15cm长的小段，水冲洗干净后用浓度为70％酒精浸泡10min，然后用无菌水冲洗、晾干，枝条两端用石蜡封口待用；c、用浸泡浓度为70％酒精的脱脂棉球擦拭消毒划布轮，待酒精晾干用划布轮刺伤树皮，刺伤长度至2cm，备用；d、用打孔器在已培养好的PDA培养平板上打孔，取步骤a得到的菌饼贴在步骤c的刺伤部位，在接种上方0.5cm处覆一块脱脂棉，用移液枪在棉球上方悬空滴加800μl的无菌水使棉球浸湿，再用封口膜将其和接种体同时包扎；e、将滤纸浸湿铺平托盘，再将步骤d已接好菌的树枝平放置托盘，用保鲜膜覆盖好托盘，保持湿度，放置温度25℃培养8天后，记录枝条发病个数并用游标卡尺测量病斑长度；叶片接菌处理：f、选取生长完全展开的新疆野苹果、栽培苹果或栽培海棠叶片，大小均一，连叶柄处剪下，用自来水洗干净，用浓度为70％的酒精擦拭消毒叶片表面，再用已灭菌的二次水冲洗干净叶片表面酒精，在超净工作台中晾干待用；g、在培养方皿中平铺滤纸，加入已灭菌的二次水使本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苹果腐烂病病原菌快速接菌及致病力快速鉴定的方法，其特征在于按下列步骤进行：苹果腐烂病病原菌的培养：a、采用PDA平板培养腐烂病病原菌，用直径5mm打孔器在黑腐皮壳菌

【技术特征摘要】
1.一种苹果腐烂病病原菌快速接菌及致病力快速鉴定的方法，其特征在于按下列步骤进行：苹果腐烂病病原菌的培养：a、采用PDA平板培养腐烂病病原菌，用直径5mm打孔器在黑腐皮壳菌Valsamali03-8的菌落边缘打孔，所取下来的菌饼接种在PDA平板的中央，温度25℃暗培养3天待用，其中所用菌株黑腐皮壳菌Valsamali03-8为腐烂病的强致病力菌株；枝条接菌处理：b、选取健康的新疆野苹果、栽培苹果或栽培海棠枝条，截成15cm长的小段，水冲洗干净后用浓度为70%酒精浸泡10min，然后用无菌水冲洗、晾干，枝条两端用石蜡封口待用；c、用浸泡浓度为70%酒精的脱脂棉球擦拭消毒划布轮，待酒精晾干用划布轮刺伤树皮，刺伤长度至2cm，备用；d、用打孔器在已培养好的PDA培养平板上打孔，取步骤a得到的菌饼贴在步骤c的刺伤部位，在接种上方0.5cm处覆一块脱脂棉，用移液枪在棉球上方悬空滴加800μl的无菌水使棉球浸湿，再用封口膜将其和接种体同时包扎；e、将滤纸浸湿铺平托盘，再将步骤d已接好菌的树枝平放置托盘，用保鲜膜覆盖好托盘，保持湿度，放置温度25℃培养8天后，记...

【专利技术属性】
技术研发人员：张道远，李小双，刘晓洁，
申请(专利权)人：中国科学院新疆生态与地理研究所，
类型：发明
国别省市：新疆,65