一种检测羊四种病原菌的多重PCR检测用引物及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测羊四种病原菌的多重PCR检测用引物及检测方法，所述引物分别为：肺炎克雷伯氏菌上下游引物、奇异变形杆菌上下游引物、大肠杆菌上下游引物和沙门氏菌上下游引物；所述检测方法采用引物，分别以肺炎克雷伯氏菌DNA、奇异变形杆菌DNA、大肠杆菌DNA、沙门氏菌DNA为模板进行多重PCR扩增反应，并将PCR 扩增反应产物加入上样缓冲液后，置于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，进行电泳检测，验证引物的特异性。本发明专利技术的有益效果是：只需要常规仪器就可以具有高敏感性的分子检测方法，这种方法的检测敏感性高，同时不需要复杂的操作系统，可以在普通实验室条件下实施检测，并具有操作简单、敏感性高、快速等特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种病原体检测技术，特别是用于检测羊体内肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌的多重PCR检测用引物及多重PCR检测方法。
技术介绍
近年来，随着我国养羊业向规模化、集约化方向发展以及各类畜禽疫病发病种类的不断增多，羊群疾病发生的种类在不断增加，而且发病率显著上升，肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、布氏杆菌和葡萄球菌等是导致羊群发病的主要细菌性病原菌（贾俊元，2009），而且细菌多重感染发生日益频繁、越来越普遍，给规模化养羊场造成巨大的经济损失，严重地威胁到羊养殖业的持续发展。牛钟相等(1996)报道了山羊“猝死症”是由肺炎克雷伯氏菌与凝结芽孢杆菌的混合感染导致，房海等在2005年报道了一起肺炎克雷伯氏菌导致小尾寒羊死亡。沙门氏菌和大肠杆菌都是目前世界公认的重要致病菌，包玉花等在2003年研究发现，羊大肠杆菌病一年四季均可发生，但多发于冬春舍饲时期，发病急、死亡快，可引起严重的腹泻和败血症，是危害我国养羊业的重要传染病之一；而薛俊龙2011年报道，羊大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一种急性细菌性传染病，各种年龄的羊都易感，临床上以严谊腹泻和败血症为特征，在我国内蒙，青海，宁夏，云南，山西，山东等地，该病均有发生，加之从业人员技术水平却相对滞后，使得羊大肠杆菌病成为规模化养殖场的常见病和多发病，严重影响着养羊业的发展。当前检测致病细菌方法还是以传统的细菌分离培养鉴定为主，然后进一步用免疫学方法进行血清分型及生化鉴定。传统细菌学检测方法每次仅能鉴定一种病原菌，检测周期长、灵敏度低，操作繁琐，因此，临床上迫切需要一种能够快速同时鉴定多种病原菌混合感染的检测方法。多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种DNA扩增技术，一次可以检测多个基因，实现了对多种病原菌的同步检测。有研究以Salmonella的invA、ompC、IpaB和hilA基因，E.coli的HlyA、rfbE和phoA基因，K.pneumoniae的mrkA、mrkD基因为靶基因，建立单一或双重PCR方法检测不同的病原菌，对于肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌4种导致毛皮死亡病原菌的四重PCR检测方法国内外均未见有关报道。本专利技术建立一种能够同时检测肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌的四重PCR检测方法，为快速检测导致羊发病的致病菌，及时采取有效的防制措施提供依据。随着分子生物学的发展，PCR已成为细菌检测的重要方法之一。多重PCR由Chamberian等于1988年提出以来，与常规PCR相比，多重PCR简化了检测程序，更为快捷和经济，在细菌混合感染检测上具有较大优势。应用PCR方法检测病原菌的关键是选择特异的保守基因作为靶基因，设计合适的引物，经综合分析，本研究选取肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛结构基因(mrkA)、奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因(ureR)、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因(invA)、大肠杆菌碱性磷酸酶基因(PhoA)基因作为检测的靶基因。K.pneumoniaemrkA基因是其特有的编码Ⅲ型菌毛的基因；SalmonellainvA基因是编码侵染上皮细胞表面蛋白的基因，与该菌致病性密切相关，是沙门氏菌属特有的；E.coliphoA基因是其持家基因，存在于所有E.coli中；而P.aeruginosatoxR基因是其特有的毒素基因。因此，选取以上基因作为检测靶基因能够保证检测的准确性和特异性。多重PCR影响因素较多而且复杂，本研究选取对扩增效率影响较大的退火温度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq聚合酶浓度和引物浓度5个参数进行优化，获得较好的敏感性结果，可同时扩增4条目的片段，最低检出限可达104cfu/mL。该方法临床验证结果与常规检测结果一致，具有较好的实际应用价值，对快速检测肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌具有重要价值，对预防由这4种病原菌引起的羊发病具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术检测羊细菌病多重感染时，检测周期长和敏感性低的缺点，本专利技术提供了一种检测羊四种病原菌的多重PCR检测用引物及检测方法。可以同时检测肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌，主要通过研究上述四种病原菌的特性，分别设计4对特异性引物进行多重PCR反应，扩增产物加入上样缓冲液后，再置于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，进行电泳检测，通过检测结果即可判定上述四种病原菌是否存在，整个检测方法敏感性高、特异性好、操作简便、迅速。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了一种检测羊四种病原菌的多重PCR检测用引物，所述引物为：肺炎克雷伯氏菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:1所示，肺炎克雷伯氏菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:2所示，奇异变形杆菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:3所示，奇异变形杆菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:4所示，大肠杆菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:5所示，大肠杆菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:6所示，沙门氏菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:7所示，沙门氏菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:8所示。为了更好的实现专利技术目的，本专利技术还提供一种多重PCR检测方法，所述检测方法是用于非诊疗目的，包括采用如下引物：肺炎克雷伯氏菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:1所示，肺炎克雷伯氏菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:2所示，奇异变形杆菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:3所示，奇异变形杆菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:4所示，大肠杆菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:5所示，大肠杆菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:6所示，沙门氏菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:7所示，沙门氏菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:8所示；分别以肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌的全基因组DNA为模板进行多重PCR扩增反应，并将获得的PCR扩增反应产物加入上样缓冲液后，再置于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，进行电泳检测，验证引物的特异性。所述引物为利用以肺炎克雷伯氏菌Ⅲ型菌毛结构基因、奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因、大肠杆菌碱性磷酸酶基因设计的4对特异性引物。所述多重PCR扩增反应的反应体系为每50μL反应体系中：5.0μL含Mg2+的10×PCRbuffer[750mmol/LTris-HCl(pH8.8)，200mmol/L(NH4)2SO4，0.1％Tween20，25mmol/LMgCl2]、2.5mmol/L的dNTP5.0μL、5U/μL的Taq聚合酶0.5μL、肺炎克雷伯氏菌的DNA模板1μL、奇异变形杆菌的DNA模板1μL、大肠杆菌的DNA模板1μL、沙门氏菌的DNA模板1μL、引物分别为浓度均为25pmol/μL的肺炎克雷伯氏菌上游引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测羊四种病原菌的多重PCR检测用引物，其特征在于，所述引物为：肺炎克雷伯氏菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID NO:1所示，肺炎克雷伯氏菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID NO:2所示，奇异变形杆菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID NO:3所示，奇异变形杆菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID NO:4所示，大肠杆菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID NO:5所示，大肠杆菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID NO:6所示，沙门氏菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID NO:7所示，沙门氏菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID NO:8所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测羊四种病原菌的多重PCR检测用引物，其特征在于，所述引物为：
肺炎克雷伯氏菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:1所示，
肺炎克雷伯氏菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:2所示，
奇异变形杆菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:3所示，
奇异变形杆菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:4所示，
大肠杆菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:5所示，
大肠杆菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:6所示，
沙门氏菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:7所示，
沙门氏菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:8所示。
2.一种利用权力要求1所述的检测羊四种病原菌的多重PCR检测用引物的多重PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法包括采用权利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌上游引物、肺炎克雷伯氏菌下游引物、奇异变形杆菌上游引物、奇异变形杆菌下游引物、大肠杆菌上游引物、大肠杆菌下游引物、沙门氏菌上游引物和沙门氏菌下游引物，分别以肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌的全基因组DNA为模板进行多重PCR扩增反应，并将获得的PCR扩增反应产物加入上样缓冲液后，再置于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，进行电泳检测，验证引物的特异性。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述引物为分别利用肺炎克雷伯氏菌Ⅲ型菌毛结构基因、奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因或大肠杆菌碱性磷酸酶基因设计的4对特异性引物。
4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，所述多重PCR扩增反应的反应体系为每50μL反应体系中：含Mg2+的10×PCRbuffer5.0μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱瑞良，魏凯，胡莉萍，钟世勋，彭军，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37