本发明专利技术公开了一种miR‑1290抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制胰腺癌侵袭转移药物中的应用。本发明专利技术发现了mircroRNA‑1290与胰腺癌细胞的侵袭转移的相关性，利用microRNA‑1290抑制剂磁性载药微球作为有效成分来制成药物，该药物对于胰腺癌侵袭转移具有显著的抑制作用。
MiR 1290 inhibitor magnetic targeting drug loaded microspheres in preparing anti pancreatic cancer invasion and metastasis in drug application
The invention discloses a miR inhibitor 1290 magnetic targeting drug loaded microspheres in preparing anti pancreatic cancer invasion and metastasis in drug application. The present invention found a correlation between mircroRNA and 1290 pancreatic cancer cell invasion and metastasis, drug loaded 1290 inhibitor as an active ingredient to magnetic microspheres made by microRNA drug, the drug has significant inhibitory effect on invasion and metastasis in pancreatic cancer.
【技术实现步骤摘要】
miR-1290抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制胰腺癌侵袭转移药物中的应用
本专利技术涉及药学领域，尤其是一种miR-1290抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制胰腺癌侵袭转移药物中的应用。
技术介绍
胰腺癌是一种发病隐匿、死亡率高的一种恶性肿瘤，早期诊断比较困难，确诊时已到晚期，microRNA为胰腺癌的早期诊断提供希望。MicroRNA是一种长度为17-22个核苷酸的非编码小RNA，在多种生理过程如细胞的增殖、凋亡、分化等中发挥着重要的作用。研究发现microRNA具有癌基因或抑癌基因的作用，广泛参与肿瘤的发生发展过程。胰腺癌是一种危害比较大的恶性肿瘤之一，了解其分子机制对于胰腺癌的早期诊断具有重要的意义。MicroRNA-1290是近年新发现的一种microRNA，在肺癌、胃癌等组织中均表达，能通过调控细胞周期参与肿瘤的发生发展。
技术实现思路
本专利技术的目的是：提供一种miR-1290抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制胰腺癌侵袭转移药物中的应用，它对胰腺癌侵袭转移具有显著的抑制作用。本专利技术是这样实现的：miR-1290抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制胰腺癌侵袭转移药物中的应用。miR-1290抑制剂磁性靶向载药微球作为唯一有效成分。将miR-1290抑制剂磁性靶向载药微球与药学上可接受的辅料制备成药学上可接受的剂型。为了验证本专利技术的实验效果，进行了以下体内实验：1材料和方法1.1材料TaqManMiRNA分析试剂盒购自美国ABI公司，microRNAReverseTranscriptionKit购自美国AppliedBiosystems公司，细胞侵袭能力试剂盒购自美国BDFalcon公司，蛋白质分析试剂盒购自美国Bio-Rad公司，microRNA-1290抑制剂购自美国Ambion公司，COX-2抗体、MMP-2抗体、羊抗兔抗体均购自美国sigma公司，荧光定量PCR分析仪(AB7500)。1.2方法细胞培养传代：将胰腺癌细胞系接种于25ml的培养瓶中，加入4ml的含10％胎牛血清、100ug/ml链霉素和100U/ml青霉素的高糖DMEM培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每隔24-48h小时换一次液，待细胞贴壁生长至约80％融合后，进行传代。免疫组化检测胰腺癌组织的microRNA-1290：通过将病理科收集临床组织标本制成组织芯片，包括30份胰腺癌组织、10份正常癌旁组织，将组织石蜡切片脱蜡、水化、去蛋白、去除内源性过氧化物酶以及预杂交处理，然后与生物素标记的microRNA-1290反义寡核苷酸探针杂交，杂交炉中反应55℃过夜，水洗，加入DAB显色液显色，室温下反应3-5min，水洗后用苏木精复染色，梯度酒精脱水后中性树胶封片，同时设置阴性对照。棕色为阳性，用相应软件计算出microRNA-1290的光密度值。FQ-PCR检测microRNA-1290的表达：TRizol法提取胰腺癌细胞系的总RNA，首先按试剂盒说明书配置好逆转录反应液，7μl逆转录反应液，5μl总RNA与3μl逆转录引物混合均匀，进行逆转录反应，逆转录反应程序如下：16℃30min，42℃30min，85℃5min。反应结束后，用三蒸水稀释逆转录产物，2μl的cDNA和1μlTaqMan探针，10μlTaqManPCRMix，7μl三蒸水混合，共20μl反应体系，反应程序如下：95℃10min，95℃15s，60℃60s，共40个循环。细胞侵袭能力分析：microRNA-1290抑制剂瞬时转染对数生长期的胰腺癌细胞，24h后收集细胞计数，接种4×105个细胞(0.1ml)到Transwell上室中，下室为0.5ml完全培养基，继续培养24h，弃去Transwell上室的培养基，乙醇固定后，吉姆萨染色，轻轻刮去上表面的胰腺癌细胞，镜检计数。随机选6个视野细胞计数，计算平均值，根据细胞数的变化判断细胞的侵袭能力。WesternBlot检测肿瘤侵袭相关蛋白COX-2、MMP-2的表达：microRNA-1290抑制剂瞬时转染对数生长期的胰腺癌细胞，24h后收集细胞，提取胰腺癌细胞系中的总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，电转移至PVDF膜，5％的脱脂奶粉封闭，加入一抗室温孵育1h，清洗3次，加入二抗室温孵育1h，清洗3次，加入化学发光底物，拍照。1.3统计学分析使用SPSS17.0对实验数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差表示，采用单因素方差分析差异显著性，P＜0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1不同胰腺组织中microRNA-1290的表达胰腺癌组织中microRNA-1290的表达显著高于正常胰腺组织以及癌旁组织(P＜0.05)，癌旁组织与正常胰腺组织相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1。2.2不同胰腺癌细胞系中microRNA-1290的表达与正常的胰腺细胞相比，不同胰腺癌细胞系中microRNA-1290的表达量均显著升高(P＜0.05)。microRNA-1290在PaCa-2、BXDC-3胰腺癌细胞系中的表达量显著高于其他胰腺癌细胞系(P＜0.05)，由于PaCa-2细胞系容易获取，且高表达microRNA-1290，因此选用PaCa-2细胞系进行下一步实验，见图2。2.3microRNA-1290抑制剂对胰腺癌细胞系PaCa-2侵袭转移的影响用microRNA-1290抑制剂处理胰腺癌细胞系PaCa-2后，细胞转移的细胞数为(425±24)，对照组转移的细胞数为(854±33)，两组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图3。2.4microRNA-1290抑制剂对PaCa-2侵袭相关蛋白MMP-2、COX-2表达的影响MicroRNA-1290抑制剂能抑制胰腺癌细胞系PaCa-2侵袭相关蛋白MMP-2、COX-2的表达，见图4。2.5microRNA-1290磁性载药微球的构建将适量的PEG4000、microRNA-1290水溶液、磁流体、白蛋白混合搅拌，分溶解混合后加入与含有表面活性剂Span80的蓖麻油100ml混合，拌10min，充分乳化，取蓖麻油100IIll加热至160℃，入上述乳浊液，60℃保温10min，后室温恒速搅拌6h。加乙醚200rIll脱脂，离心，去油相，淀依次用乙醚、乙醇漂洗，后置换在蒸馏水中，冷冻干燥48h。基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2,MMP-2)是一种蛋白水解酶，由成纤维细胞、内皮细胞等分泌，存在于多种肿瘤组织中，通过降解基底膜和细胞外基质，参与肿瘤新生血管的形成以及肿瘤细胞的生长，从而促进肿瘤的侵袭和转移。环氧合酶(cyclooxygenase,COX)是一种膜结合蛋白，是前列腺素合成过程中的重要限速酶，包括COX-1及COX-2两种同工酶，其中COX-2在胰腺癌的发生发展及胰腺癌血管生成中发挥重要作用。因此本专利技术选用MMP-2、COX-2与胰腺癌侵袭转移相关的肿瘤标志物。本专利技术结果发现不同的胰腺癌细胞系中microRNA-1290均高表达，由此可知，microRNA-1290是一种癌基因。用microRNA-1290抑制剂处理胰腺癌细胞系后，有效抑制了癌细胞的侵袭转移以及MMP-2、COX-2的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种miR‑1290抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制胰腺癌侵袭转移药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种miR-1290抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制胰腺癌侵袭转移药物中的应用。2.根据权利要求1所述的miR-1290抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制胰腺癌侵袭转移药物中的应用，其特征在于：MicroRNA-1290磁性靶...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙诚谊，张宏，喻超，田舍，何志伟，陈玲，舒漪，
申请(专利权)人：孙诚谊，
类型：发明
国别省市：贵州,52
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