一种甘薯曲叶病毒的LAMP检测引物组及其可视化检测方法技术

本发明专利技术公布了一种甘薯曲叶病毒的LAMP检测引物组及其可视化检测方法，专用于甘薯曲叶病毒特异性检测。所述检测引物组，包括如下二个引物对：外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP，核苷酸序列如SEQ NO.1‑4所示。通过DNA提取、LAMP恒温扩增后显色反应或电泳出现特异性梯形带。本发明专利技术针对甘薯曲叶病毒建立的环介导等温扩增技术具有扩增快速高效、特异性好、操作简便、不需要特殊仪器等优点，为甘薯曲叶病毒防治提供技术依据。

【技术实现步骤摘要】
一种甘薯曲叶病毒的LAMP检测引物组及其可视化检测方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种甘薯曲叶病毒的LAMP检测引物组及其可视化检测方法。
技术介绍
甘薯是无性繁殖作物，主要通过块根或秧蔓进行繁殖，如果受到病毒感染，就会代代相传，从而影响甘薯的正常生长发育，造成产量损失，种质和种性退化。甘薯曲叶病毒(Sweetpotatoleafcurlvirus，SPLCV)是侵染甘薯的主要病毒之一，近年来在我国主要甘薯产区严重发生，给甘薯生产带来严重的危害，发生严重导致甘薯绝产，造成巨大的经济损失。甘薯曲叶病毒属双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)成员，SPLCV是典型的DNA病毒，由烟粉虱(Bemisiatabaci)以持久方式传播。SPLCV侵染甘薯后，甘薯叶片卷曲，坏死、花叶等症状。目前，甘薯病毒病病尚无特别有效的化学防治方法，因此，建立高效、快速、实用的病毒检测技术，加强对甘薯病毒的监测和预警，对甘薯病毒病的防控具有重要的意义。目前检测双生病毒的检测方法有：血清学检测、PCR检测、核酸杂交、滚环扩增法、深度测序技术、环介导恒温扩增技术。ELISA检测特异性差，而RT-PCR检测方法需要昂贵的专业仪器，且扩增时间较长。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一种快速、灵敏、特异和可视化的检测技术，该技术采用4条特异引物识别靶序列上6个特异区，利用DNA链置换聚合酶(BstDNApolymerase)在恒温条件下对靶基因扩增，具有便捷、快速、准确等优点。迄今为止，LAMP在动植物病毒检测中得到了广泛的应用。与ELISA和RT-PCR技术相比，LAMP具有快速、准确、便捷，成本低，不需要昂贵的PCR仪，直接观察反应颜色判断检测结果，适合基层单位应用等优点，因此该检测技术在甘薯病毒检测和鉴定上具有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题，在于针对现有技术中的甘薯曲叶病毒的传统的检测方法所需的检测周期长，特异性差，检测需要昂贵的仪器等问题，提供一种甘薯曲叶病毒的快速、灵敏度高、特异性强的LAMP检测引物组及其可视化检测方法，可用于开发适合田间甘薯生产中开展实地检测的快速检测试剂盒，从而保障甘薯健康生产。本专利技术是这样实现的：一种甘薯曲叶病毒的LAMP检测引物组，包括如下二个引物对：外引物F3：5'-CTACACTGGGAATGCTGTCC-3'外引物B3：5'-CAGACAAACGTTCCCGTGT-3'内引物FIP：5'-ACCCCTCCTTCTCTTCATCCGGCAATTGCTGCCCGAAGCT-3'内引物BIP：5'-GACCGCATCCCGAAGGGATGGGGGAACGTCCATCTTGAAC-3'。利用上述的检测引物组进行甘薯曲叶病毒的LAMP可视化检测方法，包括以下步骤：(1)DNA提取：对样本进行处理，抽提样本DNA；(2)LAMP扩增：以经步骤(1)提取的DNA为模板，采用所述的LAMP检测引物组进行LAMP反应。进一步地，步骤(2)所述LAMP反应的反应体系为25μL，其中含模板DNA1μL，其余各组份的终浓度为：20mMTris-HCl、10mM(NH4)2SO4、8.0mMMgSO4、50mMKCl、0.2mM甜菜碱Betaine、1.4mmol·L-1dNTPs、BstDNA聚合酶8U、1.6μmol·L-1的FIP和BIP、0.2μmol·L-1的F3和B3、钙黄绿素50μmol·L-1、氯化锰500μmol·L-1、Tween-200.1wt％，加无菌双蒸水补充至25μL。进一步地，步骤(2)所述LAMP反应的条件为65℃1h，85℃灭活10min，冰上终止反应。进一步地，LAMP反应结束后，显色结果为绿色荧光的判断为阳性，显色结果为橙色的判断为阴性，或取反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，出现梯形条带的判断为阳性，无条带的判断为阴性。本专利技术还保护了所述的甘薯曲叶病毒的LAMP检测引物组在制备甘薯曲叶病毒检测试剂盒中的应用。本专利技术具有如下优点：1、结果可靠：本专利技术所设计出的LAMP检测引物，已经对采集分离自不同地点的甘薯曲叶病毒进行了测试验证，因此对结果可靠性具有充分的保证。2、特异性强：本专利技术所采用的LAMP引物是针对甘薯曲叶病毒AV1序列中6个不同区域设计出4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，同时扩增其他感染番茄黄化曲叶病毒、甘薯羽状斑驳病毒、甘薯G病毒和黄瓜花叶病毒的阳性样品，均没有扩增出特异条带，因此该方法特异性较强。3、灵敏度高：LAMP对甘薯曲叶病毒的检测灵敏度在DNA水平上可达到9.12×10-4ngμL-1，具有较高的灵敏度。4、操作简便：本专利技术在等温条件下进行，只需一个恒温设备即可，不需要昂贵的仪器设备和试剂。5、快速直观：对甘薯曲叶病毒进行检测可在1小时内完成，恒温扩增过程中加入了钙黄绿素(Calcein)，在反应结束后不用打开盖子就能直接观测结果，实现了可视化的检测方法。本专利技术针对甘薯曲叶病毒建立的环介导等温扩增技术具有扩增快速高效、特异性好、操作简便、不需要特殊仪器等优点，有较高的应用价值，在基层检测中有很好的应用前景。附图说明下面参照附图结合实施例对本专利技术作进一步的说明。图1为本专利技术中实施例一的LAMP检测结果图；其中M:DL2000DNAmarker，1：LAMP产物，2：阴性对照。图2为本专利技术中实施例二的LAMP特异性验证图；M:DL2000DNAmarker；1-5分别为SPLCV、TYLCD、SPFMV、SPVG、CMV。图3为本专利技术中实施例三的LAMP灵敏度检测图；M:DL2000DNAmarker；1-7分别表示浓度为1:9.12×10-1ngμL-1；2:9.12×10-2ngμL-1；3:9.12×10-3ngμL-1；4:9.12×10-4ngμL-1；5:9.12×10-5ngμL-1；6:9.12×10-6ngμL-1；7:9.12×10-7ngμL-1。图4为LAMP检测SPLCV的应用；其中1；2；5；6；7；8；9；11出现荧光绿色为阳性反应，3；4；10；12出现橙色为阴性反应。具体实施方式实施例一本专利技术的一种甘薯曲叶病毒的LAMP可视化检测方法，根据GenBank公布的SPLCV较保守的CP基因序列为靶标基因，应用LAMP引物设计软件primerexplorer4.0(http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计引物，得到针对6个区域的4条特异性引物。应用DNA链置换聚合酶(BstDNApolymerase),在恒温条件下快速对靶基因进行LAMP扩增检测。其中，各引物对具体为：外引物F3：5'-CTACACTGGGAATGCTGTCC-3'外引物B3：5'-CAGACAAACGTTCCCGTGT-3'内引物FIP：5'-ACCCCTCCTTCTCTTCATCCGGCAATTGCTGCCCGAAGCT-3'内引物BIP：5'-GACCGCATCCCGAAGGGATGGGGGAACGTCCATCTTGAAC-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甘薯曲叶病毒的LAMP检测引物组，其特征在于：包括如下二个引物对：外引物F3：5'‑CTACACTGGGAATGCTGTCC‑3'外引物B3：5'‑CAGACAAACGTTCCCGTGT‑3'内引物FIP：5'‑ACCCCTCCTTCTCTTCATCCGGCAATTGCTGCCCGAAGCT‑3'内引物BIP：5'‑GACCGCATCCCGAAGGGATGGGGGAACGTCCATCTTGAAC‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种甘薯曲叶病毒的LAMP检测引物组，其特征在于：包括如下二个引物对：外引物F3：5'-CTACACTGGGAATGCTGTCC-3'外引物B3：5'-CAGACAAACGTTCCCGTGT-3'内引物FIP：5'-ACCCCTCCTTCTCTTCATCCGGCAATTGCTGCCCGAAGCT-3'内引物BIP：5'-GACCGCATCCCGAAGGGATGGGGGAACGTCCATCTTGAAC-3'。2.一种利用权利要求1所述的LAMP检测引物组的甘薯曲叶病毒的LAMP可视化检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)DNA提取：对样本进行处理，抽提样本DNA；(2)LAMP扩增：以经步骤(1)提取的DNA为模板，采用权利要求1所述的LAMP检测引物组进行LAMP反应。3.根据权利要求2所述的甘薯曲叶病毒的LAMP可视化检测方法，其特征在于：步骤(2)所述LAMP反应的反应体系为25μL，其中含模板DNA1μL，其余各组份的终浓度为：20...

【专利技术属性】
技术研发人员：李华伟，刘中华，邱思鑫，林志坚，纪荣昌，邱永祥，林赵淼，李国良，张鸿，许泳清，罗文彬，汤浩，
申请(专利权)人：福建省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35