一种直观的生物膜电活性检测方法技术

本发明专利技术公开了一种直观的生物膜电活性检测方法。本发明专利技术将生物膜燃料电池和量子点结合起来，选用IIB‑VIA族元素作为前体化合物，利用生物膜电子转移能力将前体化合物1还原，还原态前体化合物1与前体化合物2金属离子结合，从而合成半导体纳米颗粒，即量子点；生物膜合成量子点能力与其电活性相关，因此合成量子点的荧光强度能够直观反映生物膜的电活性。

An intuitive method for detecting electrical activity of biomembrane

The invention discloses an intuitive method for detecting electrical activity of biomembrane. The invention combines biological membrane fuel cell and quantum dots, using IIB VIA elements as a precursor compound, using biological membrane electron transfer ability of precursor compounds of 1 reduction, reduced precursor compound 1 and compound 2 precursor metal ion binding, thus the synthesis of semiconductor nanoparticles, namely quantum dots; biofilm the synthesis of quantum dots and its electrical activity ability, so the fluorescence intensity of the synthesis of quantum dots can directly reflect the electrical activity of the biofilm.

【技术实现步骤摘要】
一种直观的生物膜电活性检测方法
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种直观的生物膜电活性检测方法。
技术介绍
生物膜(biofilm)也称为生物被膜，是指附着于固态载体表面被细菌胞外多聚物包裹的有组织的细菌群体。生物膜的形成过程，主要包括细菌起始粘附、生物膜生长和成熟扩散。通过人工强化作用将生物膜引入到城市生活废水处理的污水处理反应器中，便形成了生物膜反应器。生物膜反应器用于城市污水处理厂的二级生物处理，具有运行稳定、抗冲击负荷强、经济节能、具有一定的硝化反硝化功能、可实现封闭运转防止臭味等优点。生物膜降解有机污染物涉及了电子的胞外转移过程。生物膜与载体的胞外电子交换活性也称为电活性。检测生物膜的电活性是制备高效生物膜的必要手段。传统的电化学法和光谱法可用于电活性生物膜功能蛋白的表征而不能直观的检测电活性。激光共聚焦显微镜表征法，因其有原位和非破坏性的优点，而广泛应用于测量生物膜的表面覆盖度、生物量、厚度和粗糙度等。然而，激光共聚焦显微镜法表征生物膜常用有机荧光染料，容易发生光漂白，不适宜长时间观察，只适用于死活菌分析，而不能反映生物膜电活性。因此专利技术直观的生物膜电活性检测方法具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种生物膜电活性检测方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种生物膜电活性检测方法，包括下列步骤：1)在电解池中将工作电极、参比电极和辅助电极组成三电极体系反应器；2)向三电极体系反应器加入乙酸钠培养基，并接种产电微生物，运行三电极体系反应器；3)监测反应器产生电流情况；4)待三电极体系反应器稳定输出电流后，向其中加入前体化合物1溶液，间隔一段时间后加入前体化合物2溶液，继续厌氧培养70-80小时；其中，前体化合物1选自亚硒酸钠、亚碲酸钠、半胱氨酸；前体化合物2选自氯化镉、乙酸镉、硝酸镉、氯化锌、乙酸锌；5)将电极(反应器阳极)取出，以激光共聚焦显微镜检测电极表面生物膜荧光强度得到生物膜电活性大小。优选的，工作电极为ITO导电玻璃、石墨板、碳布等。优选的，参比电极为饱和甘汞电极。优选的，辅助电极为钛丝、石墨板。优选的，乙酸钠培养基中乙酸钠的含量为0.5-5g/L；乙酸钠作为电子供体，产电微生物氧化乙酸钠产生电子。优选的，乙酸钠培养基包含0.8-1.5g/L的乙酸钠、缓冲液体系、维生素和微量元素。乙酸钠培养基为产电微生物提供养分和电子供体。优选的，乙酸钠培养基，按照每1L计算包括下列组分：CH3COONa1g，Na2HPO4·12H2O11.4g，NaH2PO4·2H2O2.77g，KCl0.13g，维生素贮存液12.5mL、微量元素贮存液12.5mL。每升维生素贮存液含：2mg维生素H，2mg维生素B，10mg维生素B6，5mg核黄素，5mg维生素B1，5mg尼克酸，5mg维生素B3，0.1mg维生素B12，5mg对氨基苯甲酸和5mg硫辛酸。每升微量元素贮存液含：1.5g次氮基三乙酸三钠，3gMgSO4·7H2O，0.5gMnSO4·H2O，1gNaCl，0.1gFeSO4·7H2O，0.1gCaCl2，0.1gCoCl2·6H2O，0.1gZnSO4·7H2O，0.1gCuSO4·5H2O，0.1gAlK(SO4)2·12H2O，0.1gH3BO3，0.025gNa2MoO4，0.024gNiCl2·6H2O，0.025gNa2WO4·2H2O。优选的，产电微生物选自地杆菌(Geobacter)或希瓦氏菌(Shewanella)。优选的，向三电极体系反应器加入乙酸钠培养基，并接种产电微生物，利用乙酸钠作为碳源，进行产电微生物的培养，产电微生物会富集在工作电极上，形成生物膜。优选的，接种产电微生物时，接种产电微生物菌种，或包含产电微生物的微生物燃料电池培养液。优选的，包含产电微生物的微生物燃料电池培养液是指：在微生物燃料电池中加入碳源为乙酸钠的微生物燃料电池液体培养基并接种产电微生物(地杆菌或希瓦氏菌)，然后运行微生物燃料电池，待其稳定输出密度为0.1～0.6mA/cm2的电流时，得到包含产电微生物的微生物燃料电池培养液。这样做的好处是，可以获得数量可观的浮游产电微生物，加快三电极体系反应器中生物膜的形成。优选的，微生物燃料电池液体培养基的其他成分根据本行业的公知常识确定，通常包括缓冲液体系、维生素和微量元素等。优选的，监测反应器产生电流情况，待电流下降显著时，根据公知常识，一般下降接近0mA/cm2为显著下降，更换适量乙酸钠培养基。优选的，待三电极体系反应器稳定输出密度为0.1～0.6mA/cm2的电流。更优选的，待三电极体系反应器稳定输出密度为0.1～0.6mA/cm2的电流并且持续3个周期。优选的，加入前体化合物1的终浓度为0.1～1mM。如果加入的量过大，会抑制微生物活性。优选的，加入前体化合物2的终浓度为0.1～1mM。本专利技术在三电极体系反应器中培养产电微生物，产电微生物富集在工作电极表面形成生物膜。电活性生物膜，能够将氧化有机物产生的电子转移至胞外载体。本专利技术优选乙酸钠作为碳源，利用产电微生物降解乙酸钠产生电子，待电流输出稳定后，加入前体化合物1以及前体化合物2，前体化合物1产生的还原态离子(如硒离子)与前体化合物2(如镉离子)结合形成纳米尺寸的半导体颗粒(如硒化镉纳米颗粒)，也即量子点。量子点是一种半导体纳米颗粒，具有荧光寿命长、发射波长可调和抗光漂白等优点。本专利技术中量子点也同样原位富集在工作电极表面。结合激光共聚焦显微镜技术，原位合成的荧光量子点可用于生物膜的电活性直观检测。本技术是将生物膜燃料电池和量子点结合起来，来检测生物膜的电活性。本技术的关键点在于：选用IIB-VIA族元素作为前体化合物，利用生物膜电子转移能力将前体化合物1还原，还原态前体化合物1与前体化合物2金属离子结合，从而合成半导体纳米颗粒，即量子点；生物膜合成量子点能力与其电活性相关，因此合成量子点的荧光强度能够直观反映生物膜的电活性。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术所述的生物膜原位合成荧光量子点具有反应条件温和、生物相容性好、对生物膜无损伤等优点。(2)本专利技术所述的生物膜原位合成荧光量子点具有荧光寿命长和抗光漂白的优点，可实现生物膜的长时间观察。(3)本专利技术所述的原位合成量子点的生物膜检测方法，可用于生物膜的电活性的直观检测。附图说明图1为生物膜原位合成量子点示意图；图2为量子点的透视电镜图；图3为量子点的扫描电镜图；图4为生物膜的激光共聚焦显微镜图；图5为碳布为载体的生物膜激光共聚焦显微镜图。具体实施方式生物膜原位合成量子点原理如图1所示，微生物膜将降解有机物(乙酸钠)产生的电子转移至前体化合物1(例如亚硒酸钠)，前体化合物1产生的还原态离子与前体化合物2(如镉离子)结合形成纳米尺寸的半导体颗粒(如硒化镉纳米颗粒)。具体步骤如下：1)以螺口玻璃瓶为反应器池体、ITO导电玻璃为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、钛丝为辅助电极，构建三电极体系反应器。2)向步骤1)装配的反应器加入产电微生物菌种，或包含产电微生物的微生物燃料电池培养液以及乙酸钠培养基作为电子供体。优选的，产电微生物选自地杆菌(Geobacter)或希瓦氏菌(Shewanella)。乙酸钠培养基成分包括：CH3COONa(1g/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物膜电活性检测方法，其特征在于，包括下列步骤：在电解池中将工作电极、参比电极和辅助电极组成三电极体系反应器；向三电极体系反应器加入乙酸钠培养基，并接种产电微生物，运行三电极体系反应器；监测反应器产生电流情况；待三电极体系反应器稳定输出电流后，向其中加入前体化合物1溶液，间隔一段时间后加入前体化合物2溶液，继续厌氧培养70‑80小时；其中，前体化合物1选自亚硒酸钠、亚碲酸钠、半胱氨酸；前体化合物2选自氯化镉、乙酸镉、硝酸镉、氯化锌、乙酸锌；通过检测电极表面生物膜荧光强度得到生物膜电活性。

【技术特征摘要】
1.一种生物膜电活性检测方法，其特征在于，包括下列步骤：在电解池中将工作电极、参比电极和辅助电极组成三电极体系反应器；向三电极体系反应器加入乙酸钠培养基，并接种产电微生物，运行三电极体系反应器；监测反应器产生电流情况；待三电极体系反应器稳定输出电流后，向其中加入前体化合物1溶液，间隔一段时间后加入前体化合物2溶液，继续厌氧培养70-80小时；其中，前体化合物1选自亚硒酸钠、亚碲酸钠、半胱氨酸；前体化合物2选自氯化镉、乙酸镉、硝酸镉、氯化锌、乙酸锌；通过检测电极表面生物膜荧光强度得到生物膜电活性。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：工作电极为ITO导电玻璃、石墨板、碳布等。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：参比电极为饱和甘汞电极。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：辅助电极为钛丝、石墨板。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：温俊林，周顺桂，余震，陈俊华，杨贵芹，汤佳，
申请(专利权)人：广东省生态环境技术研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44