一种利用两步重叠PCR法获取人体组织中MYC基因的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种利用两步重叠PCR法获取人体组织中MYC基因的方法。该方法，包括：(1)TES水浴脱蜡；(2)提取人体组织样本的DNA；(3)查找并选择7条长度相同的MYC基因序列；(4)设计16条MYC基因的特异性引物；(5)两步重叠PCR扩增；(6)纯化DNA片段；(7)测定DNA浓度；(8)基因检测。利用本发明专利技术，准确度高、效率高，脱蜡效果更好，对环境与人体的损伤更小，操作简单、成本低廉，扩增出5279bp不同序列的MYC目的基因的DNA片段，目的基因的纯度及浓度较高，通过测序法验证了目的基因的片段，为生物医学的研究提供便利。

【技术实现步骤摘要】
一种利用两步重叠PCR法获取人体组织中MYC基因的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种利用两步重叠PCR法获取人体组织中MYC基因的方法。
技术介绍
福尔马林固定石蜡包埋技术是临床病理诊断中使用最广泛的。在福尔马林固定石蜡包埋技术中，福尔马林作为固定剂，能够减小组织形态在一定时间内的变化，为后续的免疫组化、组织学分析及基因诊断等方面提供可靠的保障。现有的福尔马林固定石蜡包埋技术仍存在如下缺陷：首先，标本中提取出的DNA浓度较低、片段较短，随着时间的推移，标本的质量逐渐降低，使得获取完整的基因变得相当困难，而DNA的片段化会导致目的基因缺失完整性，使得检测结果不可靠、数据拼接更困难，从而无法分析MYC全长基因的单倍型信息，给临床检验与医学科学研究造成很大的障碍；其次，现有的石蜡包埋组织脱蜡方法中常采用二甲苯脱蜡法，但是二甲苯易污染环境、对人体有害，而且抽提过程较长；再次，目前获取目的DNA片段的方法有PCR、酶切、基因芯片、杂交捕获等，但是获得的片段存在容易断裂、纯度与浓度较低、杂质较多、长度较短等问题，同时，普遍用于福尔马林固定石蜡包埋人体组织DNA检测的二代测序法也存在着读长较短、测序深度太大以及对高GC区域、重复区域和碱基修饰区域不敏感等问题，使得信息拼接量较大，无法将MYC基因测通，从而增加了长片段DNA结果分析的难度。因此，急需建立一种从福尔马林固定石蜡包埋人体组织中获取高质量、高浓度及完整性较强的长片段目的基因的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种获取人体组织中MYC基因的方法，利用TES水浴脱蜡及两步重叠PCR法，从福尔马林固定石蜡包埋人体组织中获取长片段DNA，即MYC基因，并利用Sanger测序进行验证。本专利技术解决上述技术问题的技术方案为：一种利用两步重叠PCR法获取人体组织中MYC基因的方法，包括如下步骤：(1)取福尔马林固定石蜡包埋人体组织样本，按照8μm～12μm的厚度切片，再进行TES水浴脱蜡操作，其中，TES水浴脱蜡操作的过程为：加入800μL～1200μL的TES(三羟甲基甲胺基乙磺酸)溶液，充分震荡后，在50℃～60℃下孵育25min～35min，再次充分震荡并混合均匀，再在4℃下、转速为8000rpm～14000rpm的离心机下离心10min～15min，弃去上清液，并重复TES水浴脱蜡操作2～3次；(2)提取经过脱蜡后的人体组织样本的DNA；(3)查找并选择7条长度相同的MYC基因序列；(4)根据步骤(3)查找到的MYC基因序列，设计16条MYC基因的特异性引物，其序列号如下：第1条：F1-AGAAGGGCAGGGCTTCTCA、R1-ATCTAACTCGCTGTAGTA；第2条：F2-AAAGAACGGAGGGAGGGAT、R2-TATGGGCAAAGTTTCGTGG；第3条：F3-CGAAACTTTGCCCATAGC、R3-TGGACTTCGGTGCTTACCTG；第4条：F4-GGTAAGCACCGAAGTCCAC、R4-AAAGCAGGAATGTCCGAC；第5条：F5-CGGACATTCCTGCTTTATTG、R5-AGGAGAATCGGACACATCC；第6条：F6-TGTCCGATTCTCCTGGA、R6-GCACTCAATACGGAGATGC；第7条：F7-TCTCCGTATTGAGTGCGA、R7-TTAGTGAACCAGCGGCTTG；第8条：F8-AGCCGCTGGTTCACTAA、R8-GTCGCAGTAGAAATACGGC；第9条：F9-GTATTTCTACTGCGACGAGG、R9-CCAAGGTTTCAGAGGTGATG；第10条：F10-AACCTTGGGCTTTAGCG、R10-TTCATACACTCCCTGCCAC；第11条：F11-CACTTCTTCTTACCTCCCGT、R11-TTCCCAAGCACCTCCTAT；第12条：F12-AGGTGCTTGGGAATGTG、R12-CACCTGTAATCCCAGCACT；第13条：F13-CCAAAGTGCTGGGATTACA；R13-TGCGTAGTTGTGCTGATG第14条：F14-CACATCAGCACAACTACGC、R14-TGGACGGACAGGATGTATGC；第15条：F15-CATACATCCTGTCCGTCCA、R15-AGACTCAGCCAAGGTTGTGA；第16条：F16-CCTTGGCTGAGTCTTGAGA、R16-AATAAAATAACTGGCA；(5)重叠PCR扩增：其中，重叠PCR扩增分为两步，具体为：第一步PCR扩增：利用步骤(4)中的16条MYC基因的特异性引物对步骤(2)中提取的DNA进行PCR(聚合酶链式反应)扩增实验，从而扩增MYC基因的DNA片段，获得16条扩增产物；PCR扩增的条件为：预变性：93℃～95℃、4min～6min；变性：93℃～95℃、30s～45s；退火：50℃～60℃、30s～1min；延伸：72℃、40s～1min；最终延伸：72℃、7min～10min；保存：4℃；其中，变性、退火、延伸这一过程循环30～40次；第二步PCR扩增：将第一步PCR扩增的16条扩增产物每个取2μL并与19μL正向引物、19μL反向引物充分混合，进行PCR扩增反应，从而扩增出全长为5279bp的DNA片段；其中，正向引物为步骤(4)中F1-AGAAGGGCAGGGCTTCTCA，反向引物为步骤(4)中R16-AATAAAATAACTGGCA；PCR扩增反应的条件为：预变性：95℃、4min；变性：95℃、15s；退火：56℃、30s；延伸：72℃、6min；最终延伸：72℃、10min；保存：4℃；其中，变性、退火、延伸这一过程循环35次；(6)纯化DNA片段：加入磁珠，磁珠的体积为DNA片段体积的0.45～0.60倍，在转速为1800rpm～2000rpm的涡旋仪中涡旋10min，再去除其中的液体；加入400μL～600μL、质量浓度为70％的乙醇，混匀并去除内部液体，再次加入400μL～600μL、质量浓度为70％的乙醇，混匀并去除内部液体；加入50μL～100μL的洗脱缓冲液，在转速为2000rpm的涡旋仪中涡旋1min，保持DNA片段的浓度在100ng/μL；重复纯化DNA片段1次，获得MYC目的基因；(7)测定DNA浓度：对MYC目的基因进行定量，测定其DNA浓度，保持目的基因的DNA浓度为100ng/μL，在4℃暂时保存，或者-20℃保存1个月；(8)基因检测：对MYC目的基因进行检测对比和数据分析。利用本专利技术两步重叠PCR法获取人体组织中MYC基因的方法的有益效果为，采用TES取代二甲苯进行脱蜡操作，脱蜡效果更好，对环境与人体的损伤更小，操作简单、成本低廉；提取的DNA片段长度较短，利用两步重叠PCR法，扩增出5279bp不同序列的MYC目的基因的DNA片段，极大地提高了目的基因的纯度及浓度；应用Sanger测序法验证了目的基因的片段，为生物医学方面的进一步科研工作提供便利；本方法可将碎片DNA拼接成长片段目的基因，准确度高、效率高，所获得目的基因的DNA片段纯度与含量高。附图说明图1为两步重叠PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用两步重叠PCR法获取人体组织中MYC基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将福尔马林固定石蜡包埋人体组织样本切片，再进行TES水浴脱蜡操作；所述TES水浴脱蜡操作的过程为：加入800μL～1200μL的TES溶液，充分震荡后，在50℃～60℃下孵育25min～35min，再次充分震荡并混合均匀，再在4℃下离心10min～15min，弃去上清液，并重复TES水浴脱蜡操作2～3次；(2)提取人体组织样本的DNA；(3)查找并选择7条长度相同的MYC基因序列；(4)设计16条MYC基因的特异性引物，其序列号分别为：第1条：F1‑AGAAGGGCAGGGCTTCTCA、R1‑ATCTAACTCGCTGTAGTA；第2条：F2‑AAAGAACGGAGGGAGGGAT、R2‑TATGGGCAAAGTTTCGTGG；第3条：F3‑CGAAACTTTGCCCATAGC、R3‑TGGACTTCGGTGCTTACCTG；第4条：F4‑GGTAAGCACCGAAGTCCAC、R4‑AAAGCAGGAATGTCCGAC；第5条：F5‑CGGACATTCCTGCTTTATTG、R5‑AGGAGAATCGGACACATCC；第6条：F6‑TGTCCGATTCTCCTGGA、R6‑GCACTCAATACGGAGATGC；第7条：F7‑TCTCCGTATTGAGTGCGA、R7‑TTAGTGAACCAGCGGCTTG；第8条：F8‑AGCCGCTGGTTCACTAA、R8‑GTCGCAGTAGAAATACGGC；第9条：F9‑GTATTTCTACTGCGACGAGG、R9‑CCAAGGTTTCAGAGGTGATG；第10条：F10‑AACCTTGGGCTTTAGCG、R10‑TTCATACACTCCCTGCCAC；第11条：F11‑CACTTCTTCTTACCTCCCGT、R11‑TTCCCAAGCACCTCCTAT；第12条：F12‑AGGTGCTTGGGAATGTG、R12‑CACCTGTAATCCCAGCACT；第13条：F13‑CCAAAGTGCTGGGATTACA；R13‑TGCGTAGTTGTGCTGATG第14条：F14‑CACATCAGCACAACTACGC、R14‑TGGACGGACAGGATGTATGC；第15条：F15‑CATACATCCTGTCCGTCCA、R15‑AGACTCAGCCAAGGTTGTGA；第16条：F16‑CCTTGGCTGAGTCTTGAGA、R16‑AATAAAATAACTGGCA；(5)重叠PCR扩增：所述重叠PCR扩增分为两步，具体为：第一步PCR扩增：利用步骤(4)中的16条MYC基因的特异性引物对步骤(2)中提取的DNA进行PCR扩增，从而扩增MYC基因的DNA片段，获得16条扩增产物；所述PCR扩增的条件为：预变性：93℃～95℃、4min～6min；变性：93℃～95℃、30s～45s；退火：50℃～60℃、30s～1min；延伸：72℃、40s～1min；最终延伸：72℃、7min～10min；保存：4℃；其中，变性、退火、延伸这一过程循环30～40次；第二步PCR扩增：将第一步PCR扩增的16条扩增产物每个取2μL并与19μL正向引物、19μL反向引物充分混合，并进行PCR扩增反应，从而扩增出全长为5279bp的DNA片段；所述正向引物为步骤(4)中F1‑AGAAGGGCAGGGC TTCTCA，所述反向引物为步骤(4)中R16‑AATAAAATAACTGGCA；所述PCR扩增反应的条件为：预变性：95℃、4min；变性：95℃、15s；退火：56℃、30s；延伸：72℃、6min；最终延伸：72℃、10min；保存：4℃；其中，变性、退火、延伸这一过程循环35次；(6)纯化DNA片段：加入磁珠并涡旋10min，再去除其中的液体；加入乙醇混匀并去除内部液体后，再次加入乙醇并混匀，去除内部液体；加入洗脱缓冲液，在转速为2000rpm的涡旋仪中涡旋1min，保持DNA片段的浓度在100ng/μL；重复上述纯化DNA片段1次，获得MYC目的基因；(7)测定DNA浓度：对MYC目的基因进行定量，测定其DNA浓度，保持DNA浓度为100ng/μL，保存；(8)基因检测：对MYC目的基因进行检测对比和数据分析。...

【技术特征摘要】
1.一种利用两步重叠PCR法获取人体组织中MYC基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将福尔马林固定石蜡包埋人体组织样本切片，再进行TES水浴脱蜡操作；所述TES水浴脱蜡操作的过程为：加入800μL～1200μL的TES溶液，充分震荡后，在50℃～60℃下孵育25min～35min，再次充分震荡并混合均匀，再在4℃下离心10min～15min，弃去上清液，并重复TES水浴脱蜡操作2～3次；(2)提取人体组织样本的DNA；(3)查找并选择7条长度相同的MYC基因序列；(4)设计16条MYC基因的特异性引物，其序列号分别为：第1条：F1-AGAAGGGCAGGGCTTCTCA、R1-ATCTAACTCGCTGTAGTA；第2条：F2-AAAGAACGGAGGGAGGGAT、R2-TATGGGCAAAGTTTCGTGG；第3条：F3-CGAAACTTTGCCCATAGC、R3-TGGACTTCGGTGCTTACCTG；第4条：F4-GGTAAGCACCGAAGTCCAC、R4-AAAGCAGGAATGTCCGAC；第5条：F5-CGGACATTCCTGCTTTATTG、R5-AGGAGAATCGGACACATCC；第6条：F6-TGTCCGATTCTCCTGGA、R6-GCACTCAATACGGAGATGC；第7条：F7-TCTCCGTATTGAGTGCGA、R7-TTAGTGAACCAGCGGCTTG；第8条：F8-AGCCGCTGGTTCACTAA、R8-GTCGCAGTAGAAATACGGC；第9条：F9-GTATTTCTACTGCGACGAGG、R9-CCAAGGTTTCAGAGGTGATG；第10条：F10-AACCTTGGGCTTTAGCG、R10-TTCATACACTCCCTGCCAC；第11条：F11-CACTTCTTCTTACCTCCCGT、R11-TTCCCAAGCACCTCCTAT；第12条：F12-AGGTGCTTGGGAATGTG、R12-CACCTGTAATCCCAGCACT；第13条：F13-CCAAAGTGCTGGGATTACA；R13-TGCGTAGTTGTGCTGATG第14条：F14-CACATCAGCACAACTACGC、R14-TGGACGGACAGGATGTATGC；第15条：F15-CATACATCCTGTCCGTCCA、R15-AGACTCAGCCAAGGTTGTGA；第16条：F16-CCTTGGCTGAGTCTTGAGA、R16-AATAAAATAACTGGCA；(5)重叠PCR扩增：所述重叠PCR扩增分为两步，具体为：第一步PCR扩增：利用步骤(4)中的16条MYC基因的特异性引物对步骤(2)中提取的DNA进行PCR扩增，从而扩增MYC基因的DNA片段，获得16条扩增产物；所述PCR扩增的条件为：预变性：...

【专利技术属性】
技术研发人员：马慧，万君兴，周翔，马虎，张明贺，张薇，
申请(专利权)人：华子昂，
类型：发明
国别省市：辽宁,21