一种抗菌肽及其分离方法技术

本发明专利技术公开了一种抗菌肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术同时公开了一种抗菌肽的分离方法，包括以下步骤：步骤一、凡纳滨对虾的准备；步骤二、副溶血弧菌的制备；步骤四、血浆的制备；步骤五、抗菌肽的分离。本发明专利技术为进一步开发具有抑菌活性、抗肿瘤活性的生物制品奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种抗菌肽及其分离方法
本专利技术涉及分子生物学的
，尤其涉及一种抗菌肽及其分离方法。
技术介绍
凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)，又名为南美白对虾(PenaeusvannameiBoone)，分类学上隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、游泳亚目、对虾科、滨对虾属，原产于南美洲太平洋海岸水域。凡纳滨对虾由于具有生长速度快、对食物要求低、环境适应力强、适宜密养、单产高、肉质鲜美等特点，已经成为继中国对虾、斑节对虾的世界三大养殖虾种之一。虽然凡纳滨对虾产量逐年增长，但是伴随着凡纳滨对虾养殖的产业化、高度密集化，凡纳滨对虾养殖的问题也不断出现，养殖环境恶化引发了各种疾病的产生，凡纳滨对虾抗病能力下降，引起了大规模的死亡，造成了巨大的生态和经济损失。随着海洋药物研究的进展，已经有种类非常丰富的抗菌肽在海洋水生生物中被发现，其中甲克动物中的虾类和蟹类也发现许多抗菌肽。研究显示，在对虾的养殖过程中加入抗菌蛋白，可以显著提升对虾生长速率、相对增重率、饲料系数、成活率及抗病能力等。研究表明抗菌肽能够防治对虾病害，并且凡纳滨对虾血液中含有抗菌肽，因此分离得到抗菌肽对对虾病害的防治有重要意义。有鉴于此，本专利技术人研究和设计了一种抗菌肽及其分离方法，本案由此产生。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗菌肽及其分离方法，为进一步开发具有抑菌活性、抗肿瘤活性的生物制品奠定基础。为了解决上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种抗菌肽，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。一种抗菌肽的分离方法，包括以下步骤：步骤一、凡纳滨对虾的准备：采用新鲜的凡纳滨对虾；步骤二、副溶血弧菌的制备：a、菌种活化：把-80℃保存的副溶血弧菌在肉汤固体培养基过夜活化，按照5mL肉汤液体培养基+100μL菌种，使用摇床在37℃下恒温过夜培养12h到对数生长期；b、菌种扩培：取活化后的菌液进行扩大培养，按照50mL肉汤液体培养基+200μL活化菌液，在37℃下恒温摇床培养3h，收集菌液；c、离心、洗涤：将菌液在室温下，12000rpm离心1min，用质量分数0.85％的无菌生理盐水洗涤3次；d、计数：采用血球计数板法显微计数，用质量分数0.85％的无菌生理盐水将菌液稀释到1.0×107CFU/mL的注射浓度，于4℃保存备用；步骤三、副溶血弧菌对凡纳滨对虾的刺激：使用含有100μL副溶血弧菌菌悬液的1mL无菌注射器于凡纳滨对虾的第2或3腹节处进行肌肉注射；步骤四、血浆的制备：24小时后，先用75％酒精给对虾消毒，然后用1mL注射器直接在凡纳滨对虾的心脏抽取血淋巴，并与抗凝剂按体积比1:1混合，在4℃下，800g离心10～15min，除去大多数完整的血蓝蛋白，取上清液分装后于-20℃保存备用；步骤五、抗菌肽的分离：采用高效液相色谱分离：a、样品前处理：取出-20℃保存的血清原样，用超纯水稀释样品，上层稀释5倍，中层稀释15倍；先取处理后的样品，用注射器注入0.22微米的膜滤器除杂，再装进自动进样器的样品瓶中，放在冰块上保存；b、先将实验用的流动相A即超纯水、流动相B即乙腈超声脱气后，打开高效液相色谱仪，先冲泵，再平衡，采用梯度洗脱方法，设置洗脱条件：流速：0.3mL/min、波长：214nm、进样量：20μL、流动相A：超纯水、流动相B：乙腈(色谱纯)、0-20min：55％-60％B；c、点击开始，自动进样，跑样，收集主要色谱峰，冻干备用得到含抗菌肽的制品。作为实施例的优选方式，所述步骤二中，所述肉汤液体培养基的配方：蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl5g、加蒸馏水950mL，用1MNaOH将pH调至7.2，定容至1000mL，121℃高压灭菌20-30min，室温保存。作为实施例的优选方式，所述步骤二中，所述肉汤固体培养基的配方：称取23.5g琼脂，加1000mL蒸馏水，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌20-30min，冷却到46℃备用。由于本专利技术采用了上述的技术方案，使得本专利技术具有以下有益效果：本专利技术分离得到的抗菌肽为进一步开发具有抑菌活性、抗肿瘤活性的生物制品奠定了基础。附图说明图1为本专利技术的考染电泳图；其中，从左到右的样品依次为：maker(maker)、生1(稀释5倍的生理盐水对照组的上层血清)、Vp1(稀释5倍的副溶血弧菌刺激的上层血清)、生2(稀释15倍的生理盐水对照组的中层血清)、Vp2(稀释15倍的副溶血弧菌刺激的中层血清)；图2为本专利技术银染电泳图；其中，从左到右的样品依次为：maker(marker)、生1(稀释5倍的生理盐水对照组的上层血清)、Vp1(稀释5倍的副溶血弧菌刺激的上层血清)、生2(稀释15倍的生理盐水对照组的中层血清)、Vp2(稀释15倍的副溶血弧菌刺激的中层血清)；图3为本专利技术稀释5倍的生理盐水对照上层血清色谱图；图4为本专利技术稀释5倍的副溶血弧菌刺激得到的上层血清色谱图。具体实施方式实施例1一种抗菌肽，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。实施例22.1实验方法凡纳滨对虾，购自汕头市华勋水产有限公司牛田洋基地；实验菌种：副溶血弧菌，为汕头大学保存菌种。2.2实验方法2.2.1凡纳滨对虾的准备从汕头市华勋水产有限公司牛田洋基地购买新鲜的凡纳滨对虾。2.2.2副溶血弧菌的制备1、菌种活化：把-80℃保存的副溶血弧菌在肉汤固体培养基过夜活化，按照5mL肉汤液体培养基+100μL菌种，使用摇床在37℃下恒温过夜培养12h到对数生长期。2、菌种扩培：取活化后的菌液进行扩大培养按照50mL肉汤液体培养基+200μL活化菌液，在37℃下恒温摇床培养3h，收集菌液。3、离心、洗涤：将菌液在室温下，12000rpm离心1min，用0.85％无菌生理盐水洗涤3次。4、计数：采用血球计数板法显微计数，用0.85％的无菌生理盐水将菌液稀释到1.0×107CFU/mL的注射浓度，于4℃保存备用。作为实施例的优选方式，所述肉汤液体培养基的配方：蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl5g、加蒸馏水950mL，用1MNaOH将pH调至7.2，定容至1000mL，121℃高压灭菌20-30min，室温保存。作为实施例的优选方式，所述肉汤固体培养基的配方：称取23.5g琼脂，加1000mL蒸馏水，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌20-30min，冷却到46℃备用。2.2.3副溶血弧菌对凡纳滨对虾的刺激实验将购买的凡纳滨对虾，分成对照组和实验组，每一组100只，实验组使用含有100μL副溶血弧菌菌悬液的1mL无菌注射器于凡纳滨对虾的第2或3腹节处进行肌肉注射。对照组用等体积0.85％的无菌生理盐水代替副溶血弧菌的菌悬液。2.2.4血浆的制备24小时后，先用75％酒精给对虾消毒，然后用1mL注射器直接在凡纳滨对虾的心脏抽取血淋巴与抗凝剂(1:1)混合，在4℃下，800g离心10～15min，除去大多数完整的血蓝蛋白，取上清液分装后于-20℃保存备用。2.2.5聚丙烯酰胺凝胶电泳法1、样品前处理：取样品15μL，上样缓冲液5μL，巯基乙醇(样品的3％＝15×3％＝0.45μL)0.45μL于离心管，用封口条封口，在水中煮沸5min，然后在室温下12000r，离心5min。2、配胶：分离胶：将H2O、30％Acryl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗菌肽，其特征在于：其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽，其特征在于：其氨基酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。2.一种如权利要求1所述的抗菌肽的分离方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、凡纳滨对虾的准备：采用新鲜的凡纳滨对虾；步骤二、副溶血弧菌的制备：a、菌种活化：把-80℃保存的副溶血弧菌在肉汤固体培养基过夜活化，按照5mL肉汤液体培养基+100μL菌种，使用摇床在37℃下恒温过夜培养12h到对数生长期；b、菌种扩培：取活化后的菌液进行扩大培养，按照50mL肉汤液体培养基+200μL活化菌液，在37℃下恒温摇床培养3h，收集菌液；c、离心、洗涤：将菌液在室温下，12000rpm离心1min，用质量分数0.85％的无菌生理盐水洗涤3次；d、计数：采用血球计数板法显微计数，用质量分数0.85％的无菌生理盐水将菌液稀释到1.0×107CFU/mL的注射浓度，于4℃保存备用；步骤三、副溶血弧菌对凡纳滨对虾的刺激：使用含有100μL副溶血弧菌菌悬液的1mL无菌注射器于凡纳滨对虾的第2或3腹节处进行肌肉注射；步骤四、血浆的制备：24小时后，先用75％酒精给对虾消毒，然后用1mL注射器直接在凡纳滨对虾的心脏抽取血淋巴，并与抗凝剂按体积比1:1混合，在4℃下，800g离心10～15min，除去大多数完整的血蓝蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨燊，刘光明，章跃陵，文英，陈洁辉，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：广东,44