伯克霍尔德菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株伯克霍尔德菌，所述伯克霍尔德菌为格氏伯克霍尔德菌(Burkholderia glathei)ECU0712，保藏号为CGMCC NO.14464。以该菌株或其提取物作为生物催化剂，催化硫醚不对称氧化成手性亚砜，具有显著的优势，所得产物光学纯度高，且具有反应体系简单、催化剂制备时间短和产物得率高等优点。

【技术实现步骤摘要】
伯克霍尔德菌及其应用
本专利技术涉及一株伯克霍尔德菌及其应用于硫醚不对称氧化合成手性亚砜的方法。
技术介绍
5-甲氧基-2-((S)-((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑钠，可以用于治疗十二指肠溃荡、胃溃荡、胃炎以及消化道食管炎。化学法利用金属和有机小分子催化剂不对称氧化硫醚来合成，已取得重大的进展，但这类方法存在过度氧化、副产物多、分离提纯工艺复杂等缺点。使用生物法来对硫醚化合物进行不对称氧化，得到单一对映体的手性亚砜，这种方法环境污染小，副产物少，原子经济性好，而且产物光学纯度高，因此利用生物法不对称氧化合成手性亚砜受到了越来越多的关注。美国专利US5840552公开了利用微生物选择性氧化潜手性硫醚制备5-甲氧基-2-(-((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑单一对映体的方法，但活性极低，产物浓度在ppm级别；且公开的青霉菌Penicillinfrequentans、匍茎根霉菌Rhizopusstolonifer、玉蜀黍黑粉菌Ustilagomaydis、嗜石油节杆菌Arthrobacterpetroleophagus、短杆菌Breyibacteriumparaffinolyticum、分支杆菌Mycobacteriumsp.、不动杆菌Acinetobactersp.催化硫醚氧化全部生成5-甲氧基-2-((R)-((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑，而非所需要的5-甲氧基-2-((S)-((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑。专利技术人也曾筛选获得一株红球菌(CGMCCNO.2547)可催化一系列潜手性苯烷基硫醚及其衍生物的不对称氧化，获得了光学活性的手性苯甲亚砜及其衍生物(CN101372676A)。捷克科学家筛选获得了一株短小芽孢杆菌Lysinibacillussp.，利用其生长细胞可催化硫醚生成5-甲氧基-2-((S)-((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑，但底物浓度为0.1g/L时，44h转化率仅为43％(BioresourcesTechnology2011,102:7621–7626)。专利CN106191193A公开了一种利用固定化黑曲霉不对称氧化制备5-甲氧基-2-((S)-((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑的方法，但其细胞培养时间超过72h，且细胞加入量大，繁杂的固定化过程也增加了催化剂的制备成本。为了克服现有技术的局限，本专利技术重新设计了筛选策略，从土壤这一天然宝库中筛选新的微生物菌株，这为未来的工业应用提供新的生物催化剂资源。
技术实现思路
本专利技术在不同特性的土壤中广泛采集土样，使用不同梯度浓度的硫醚底物进行培养，对土壤中的菌株进行富集和驯化培养，筛选获得了一批能够催化硫醚不对称氧化的细菌。本专利技术第一方面，公开了一株伯克霍尔德菌，命名为格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)ECU0712。2017年7月26日该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNO.14464。本专利技术格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)ECU0712具有如下形态特征：革兰氏阴性菌、无孢子形成、杆状、宽0.6-0.9μm,长1.1-1.4μm。菌落为圆形、白色、潮湿、半透明、边缘规则。生物分类就是遵循分类学原理和方法，对生物的各种类群进行命名和等级划分。一般使用界、门、纲、目、科、属、种加以分类；种是最基本的分类单位。在生物学中，常用双名法命名为生物命名；即每个物种名字有两部分构成，属名和种加词(种名)；在科学文献的印刷出版时，一般使用斜体表示。具体菌株的命名可以采用属名+种名+菌株代号的方式，例如BurkholderiaglatheiECU0712。Burkholderia表示属名，glathei表示种名，ECU0712表示菌株代号。Burkholderia可译为伯克氏菌属，又译伯克霍尔德菌，glathei可译为格氏。伯克氏菌属已经发现的物种不少于38个，其中最常见的是Burkholderiacepacia(洋葱伯克霍尔德菌)。本专利技术所公开的格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)ECU0712可以是各种具有生命活力的状态，例如可以为生长细胞状态、静息细胞状态、或冻干细胞状态。静息细胞又称休止细胞，其处于休眠状态，不进行生长繁殖，在适宜条件下可再恢复生长。示例性的，将所述格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)ECU0712进行培养，培养混合物离心后可以获得静息细胞。通过离心获得获得静息细胞对于本领域技术人员是常规的方法；例如所述离心转速8000-10000rpm，时间为15-30min。示例性的，将所述格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)ECU0712静息细胞，采用本领域常规的冷冻干燥技术(例如实验室常规的-80℃冰箱预冻；真空度0.1-0.2mbar，温度-50℃--80℃，冷冻干燥24-48h)可以获得所述BurkholderiaglatheiECU0712冻干细胞。所述冻干细胞可以储存于4℃备用。本专利技术还公开了格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)的培养方法；所述格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)优选地为格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)ECU0712。可以通过摇瓶培养、发酵罐培养等常规培养方法进行发酵培养。示例性的发酵培养基组成为：2.0-10.0g/L蛋白胨，2.0-10.0g/L酵母膏，2.0-10.0g/L氯化钠，pH5.0-8.0。本专利技术第二方面，公开了格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)的提取物。所述格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)优选地为格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)ECU0712。本专利技术公开的格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)的提取物，包括无细胞提取液、或无细胞提取液的冻干品。所述无细胞提取液是将细胞的通过破碎、分离获得；常见的分离手段包括但不限于离心。示例性的，将细胞悬浮于缓冲液中，过滤、破碎(包括但不限于超声破碎、800-1000bar高压破碎)、离心收集上清液即得无细胞提取液；离心转速可以为14000-18000rpm，时间可以为20-30min。将无细胞提取液冷冻干燥可获得无细胞提取液的冻干品。示例性的，将无细胞提取液预冻(例如用实验室常规的-80℃冰箱)，采用常规冷冻干燥技术(例如真空度0.1-0.2mbar，温度-50℃--80℃，冷冻干燥24-48h)，即可获得无细胞提取液的冻干品。所述无细胞提取液的冻干品可储存于4℃备用。本领域技术人员能够知晓，本专利技术所述的无细胞提取液、或无细胞提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
格氏伯克霍尔德菌(Burkholderia glathei)或其提取物，其特征在于所述格氏伯克霍尔德菌(Burkholderia glathei)为格氏伯克霍尔德菌(Burkholderia glathei)ECU0712，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14464。

【技术特征摘要】
1.格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)或其提取物，其特征在于所述格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)为格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)ECU0712，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.14464。2.根据权利要求1所述的格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)或其提取物，其特征在于所述提取物为无细胞提取液、或无细胞提取液的冻干品；优选地所述无细胞提取液是将格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)通过破碎、分离获得。3.根据权利要求1所述的格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)或其提取物，其特征在于所述提取物进行了固定化。4.格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)或其提取物作为催化剂催化硫醚不对称氧化成手性亚砜的用途。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)为保藏号CGMCCNO.14464的格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)。6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述提取物为无细胞提取液、或无细胞提取液的冻干品；优选地所述无细胞提取液是将格氏伯克霍尔德菌(Burkholderiaglathei)细胞通过破碎、分离获得。7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述提取物进行了固定化；优选将所述提取物以戊二醛作为交联剂，固定化于聚乙烯亚胺。8.根据权利要求4～7中任一项所述的用途，其特征在于所述硫醚选自以下化合物或其药学上可接受的盐：化合物OME，式I中R1＝CH3O─、R2＝CH3─、R3＝CH3O─、R4＝CH3─；化合物LAN，式I中R1＝H、R2＝CH3─、R3＝CF3CH2O─、R4＝H；化合物PAN，式I中R1＝F2CHO─、R2＝CH3O─、R3＝CH3O─、R4＝H；化合物RAB，式I中R1＝H、R2＝CH3─、R3＝CH3─O─CH2─CH2─CH2O─、R4＝H；化合物ILA，式I中R2＝CH3─、R3＝CH3O─、R4＝H。9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：当硫醚为化合物OME或其药学上...

【专利技术属性】
技术研发人员：郁惠蕾，赵骞，张龑，潘江，许建和，
申请(专利权)人：华东理工大学，江苏奥赛康药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31