一种根际芽孢杆菌及其利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯的方法技术

本发明专利技术涉及一种根际芽孢杆菌及其利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯的方法，属于生物技术领域。具体地说，该根际芽孢杆菌（

【技术实现步骤摘要】
一种根际芽孢杆菌及其利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种根际芽孢杆菌及其应用，特别涉及一株筛选获得的根际芽孢杆菌及利用该菌株发酵生产乙酸己酯的方法。
技术介绍
乙酸己酯又称正己基乙酸酯，是无色油状液体，熔点是-80℃，沸点是168-171.5℃，能与乙醇、乙醚、苯等溶剂互溶，但不溶于水。乙酸己酯具有令人愉快的水果香气和梨似的酸甜味道，国标中已将乙酸己酯规定为允许使用的食用香料物质，其主要用在食用果实香精，用于配制苹果、梨等水果型香精。除此之外还可以也用于有机合成，也可作为纤维素酯类、树脂等溶剂。目前工业上生产乙酸己酯的方法仅限于化学合成法，其主要用的是以浓硫酸为催化剂，以乙酸和己醇为原料，通过酯化反应制得，此方法不但对设备有腐蚀，而且对环境会产生一定的污染。也有研究者以固体酸、强酸性交换树脂及固体路易斯酸作为酯化反应的催化剂，以期替代传统的液体强酸，减少化学催化法生产乙酸己酯对设备腐蚀，虽在一定程度上取得了一定的成效，但由于固体酸等催化剂的制备繁琐、酸性调节性差和易失活等缺点，使其在工业应用上受到了限制。除此之外，许多研究者将改善乙酸己酯的工业生产的重点放在了催化剂的选择上，在这方面也取得了不少成就，如胺型离子液体催化剂，新型固体酸催化剂等等。这些催化剂的使用虽然可以减少设备腐蚀及环境污染，但其生产过程相对较复杂。乙酸己酯的生物合成鲜有报道，其可能原因在于微生物合成乙酸己酯的效率不高，这就制约了乙酸己酯的生物合成在工业上的应用。因此如何克服现有技术的不足是目前生物
亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种根际芽孢杆菌及其利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯的方法，该菌株不仅不需要改造，而且易于分离和培养，除此之外，使用的发酵培养基还成本低廉，而且可以处理烟草工业产生的大量废弃物，在保护环境和合理利用资源方面都有着积极的作用，为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种根际芽孢杆菌（Bacillusrhizosphaerae），已于2017年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.14440。本专利技术还提供根际芽孢杆菌（Bacillusrhizosphaerae）在生产乙酸己酯中的应用。利用根际芽孢杆菌（Bacillusrhizosphaerae）生产乙酸己酯的方法，包括如下步骤：步骤（1），利用寡营养培养基从醇化中期的烟叶上分离得根际芽孢杆菌；步骤（2），将步骤（1）中得到的根际芽孢杆菌接种至发酵培养基中，发酵后，将所得发酵液纯化，即得到乙酸己酯。进一步，优选的是，步骤（1）中所述的寡营养培养基是稀释2-5倍的LB液体培养基。进一步，优选的是，步骤（2）中根际芽孢杆菌接种至发酵培养基中是指直接接种一接种环的纯培养菌体至发酵培养基中。进一步，优选的是，所述的发酵培养基包括如下组分：葡萄糖10~25g/L，烟草工业废弃物3~7g/L，pH值7.0~7.4。烟叶工业废弃物是烟叶加工过程中剔除的烟梗或者废弃的烟叶。进一步，优选的是，所述的发酵温度为30-37℃。本专利技术涉及的以烟草工业废弃物为原料生产乙酸己酯的根际芽孢杆菌（Bacillusrhizosphaerae）是从醇化中期的烟叶上通过选择性培养基分离得到的。本专利技术涉及根际芽孢杆菌为革兰阳性杆菌，有芽孢，产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊不膨大，在显微镜下观察菌体的大小为0.8μmx（3.5～5.5）μm。菌体细胞呈短杆状。在LB固体培养基表面，菌体形成不透明的乳白色菌落，菌落表面湿润平滑，边缘不整齐。上述菌株的经通用引物PCR获得16SrDNA序列与根际芽孢杆菌W12的16SrDNA序列有99%的相似性，其系统进化树如图1所示。其中，上述PCR上游引物为27F:5’-agagtttgatcctggctcag-3’（SEQIDNO.2）；下游引物为1492R：5’-cggctaccttgttacgactt-3’（SEQIDNO.3）。本专利技术方法提供了乙酸己酯的一种新来源，本专利技术菌株既不需要改造，而且易于分离和培养，除此之外，使用的发酵培养基不但成本低廉，而且可以处理烟草工业产生的大量废弃物，这在保护环境和合理利用资源方面都有着积极的作用，本专利技术提供的根际芽孢杆菌及其利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯的方法有望解决生物法生产乙酸己酯的问题，也会促进乙酸己酯的工业化生产及应用。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：1）本专利技术筛选获得根际芽孢杆菌能够利用烟草工业废弃物为主要营养源，这可处理烟草工业产生的大量废弃物，在保护环境和合理利用资源方面都有着积极的作用。2）该根际芽孢杆菌能够发酵烟草工业废弃物生产乙酸己酯。该乙酸己酯为直链型脂肪酸酯，具有浓郁果香味，其不仅广泛应用于合成香料、化妆品及饲料添加等领域，而且是制药工业的重要原料和中间体。3）本专利技术提供了乙酸己酯的一种新来源，菌株不但不需要改造，而且易于分离和培养，这也有望解决生物法生产乙酸己酯的问题，也会促进乙酸己酯的工业化生产及应用。附图说明图1该根际芽孢杆菌与相关菌种的16SrRNA基因序列系统进化树（邻接法）；图2该根际芽孢杆菌基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；图3本专利技术发酵获得乙酸己酯的质谱图；图4为对照组与实验组发酵液检测的对比气相色谱图。根际芽孢杆菌（Bacillusrhizosphaerae），已于2017年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.14440，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。实施例1利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯微生物的分离1.分离用培养基及培养条件：LB液体培养基：1000mL蒸馏水；胰化蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl10g；pH自然，灭菌；稀释2倍的LB液体培养基：1000mL蒸馏水；胰化蛋白胨5g；酵母提取物2.5g；NaCl5g；pH自然，灭菌；稀释4倍的LB液体培养基：1000mL蒸馏水；胰化蛋白胨2.5g；酵母提取物1.25g；NaCl2.5g；pH自然，灭菌；稀释5倍的LB液体培养基：1000mL蒸馏水；胰化蛋白胨2g；酵母提取物1g；NaCl2g；pH自然，灭菌；上述培养基的灭菌条件为121℃灭菌20分钟。上述培养基中添加20g/L的琼脂制备成固体培养基用于菌株筛选。2.分离方法：醇化中期的烟叶样品随机抽取2g，在无菌条件下剪碎，浸泡于150mL中无菌生理盐水中，在温度为37℃，转速为180转/分的条件下，振荡培养60分钟，用无菌单层纱布过滤，取滤液，离心弃上清，并用5mL无菌水重悬，得原始菌悬液，取100μL原始菌液分别稀释至100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，并分别吸取200μL涂布于三种分离培养基（稀释2倍的LB液体培养基、稀释4倍的LB液体培养基、稀释5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种根际芽孢杆菌（

【技术特征摘要】
1.一种根际芽孢杆菌（Bacillusrhizosphaerae），已于2017年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.14440。2.权利要求1所述的根际芽孢杆菌（Bacillusrhizosphaerae）在生产乙酸己酯中的应用。3.根据权利要求2所述的根际芽孢杆菌（Bacillusrhizosphaerae）在生产乙酸己酯中的应用，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），利用寡营养培养基从醇化中期的烟叶上分离得根际芽孢杆菌；步骤（2），将步骤（1）中得到的根际芽孢杆菌接种至发酵培养基中，发酵后，将所得发酵液纯化，即得到乙酸己酯。4.根据权利要求3所述的根际芽孢杆菌（Bacillusrhizosphaerae）在生...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴丽君，白晓莉，王毅，高锐，段如敏，朱杰，王颖琦，杨德中，刘晶，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53