纳米微粒、微球及其生物荧光探针的制备和应用制造技术

一种纳米微粒和微球生物荧光探针的制备方法。本发明专利技术方法主要包括以下两个方面：１）在微粒合成中选用带有胺基的巯基化合物作为稳定剂，在温和的条件下直接制备水溶性表面修饰有胺基的荧光纳米微粒，然后利用微粒表面的胺基直接与生物体系耦联，进而得到纳米微粒生物荧光探针；２）利用不同的方法将表面修饰有不同官能基团的上述荧光纳米微粒复合到无机二氧化硅或有机聚合物微球中得到可以在水溶液中均匀分散的荧光微球，通过对荧光微球表面进行适当的化学和生物化学修饰得到可用于生物检测的微球荧光探针。纳米微粒和微球荧光探针可用于免疫检测、多基因染色体组分析、蛋白芯片的联合检测、ＤＮＡ测序、基因芯片及细胞或生物组织内不同区域的荧光同步检测中。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及水溶性高效荧光发光的无机半导体纳米微粒的合成、含有荧光纳米微粒的可以在水中分散的大尺寸微球的制备、纳米微粒和含有荧光微粒的大尺寸微球的表面生物化学修饰及其荧光性质在生物检测中的应用，特别是碲化镉(CdTe)纳米微粒和含有碲化镉荧光微粒的大尺寸微球的表面生物化学修饰及其荧光性质在生物检测中的应用。到目前为止，已经有两种较为成熟的方法可以用于高效荧光发光(发光效率在10％以上)的半导体纳米微粒的合成。一种方法是利用金属有机合成的方法采用三烷基磷氧化物(TOPO，trioctyl phosphine oxide)作为溶剂和稳定剂在高温(～300℃)下合成II-VI族半导体纳米微粒如CdS、CdSe、ZnSe、CdTe及CdSe/CdS、CdSe/ZnS等具有壳核结构的高效荧光发光的纳米微粒，由于采用TOPO作为稳定剂，这种方法通常又被称为TOPO方法。然而TOPO方法的实验操作具有非常高的危险性，尤其是作为镉源的金属有机化合物具有非常大的毒性。此外，TOPO方法的直接产物是油溶性的纳米微粒，需要经过非常复杂的化学方法，通过对微粒表面的TOPO进行置换才能得到水溶性的纳米微粒，而微粒的水溶性是纳米微粒在生物体系中应用的重要前提。另一种合成高效荧光发光的纳米微粒的方法是在水体系中通过采用水溶性的巯基化合物(如巯基乙酸、巯基丙酸、巯基异丙酸、巯基甘油等)作为稳定剂，在温和的条件下(≤100℃)直接制备水溶性高效荧光发光的纳米微粒，如碲化镉(CdTe)纳米微粒。本专利技术的内容主要包括以下两个方面1)在微粒合成中选用带有胺基的巯基化合物(如巯基乙胺等)作为稳定剂，合成高效荧光发光的纳米微粒的方法是在水体系中通过采用不同的巯基稳定剂来得到表面修饰有胺基的荧光纳米微粒，然后利用微粒表面的胺基直接与生物体系耦联，近而得到纳米微粒生物荧光探针；2)利用不同的方法将上述荧光纳米微粒复合到无机(如二氧化硅等)或有机(如聚苯乙烯等)微球中得到可以在水溶液中均匀分散的荧光微球，通过对荧光微球表面进行适当的化学和生物化学修饰得到可用于生物检测的微球荧光探针。具体步骤如下1.表面修饰有胺基的荧光CdTe纳米微粒的制备用含有胺基的水溶性巯基化合物(巯基胺，其分子式如下图所示)或含有一定比例的巯基胺 n＝1-10；m＝0-10；X，Y＝-NH2，-OH，-COOH，-SH，-H，-CH3与其它水溶性巯基化合物如巯基乙酸、巯基丙酸、巯基甘油等的混合物作为稳定剂，在水溶液中直接合成表面修饰有胺基的CdTe荧光发光的纳米微粒，其荧光峰位在500-680纳米范围内，微粒尺寸在1-8纳米之间。通常，镉离子化合物可以采用CdCl2、Cd(ClO4)2·xH2O(x＝0～6)、Cd(CH3COO)2等水溶性的镉盐化合物；碲源化合物采用不同方法制备的NaHTe或Na2Te的水溶液；反应的投料比为Cd2+∶Te2-∶HSR＝1∶(0.1-0.8)∶(0.5-10)(其中HSR代表含有不同官能团的巯基化合物的总摩尔数)；整个反应过程是在无氧的条件下进行的，Cd2+在与NaHTe或Na2Te反应前先与巯基化合物混合，其混合溶液的pH通常在5-11.5之间；NaHTe或Na2Te溶液通过缓慢滴加方式加入到Cd2+/HSR溶液中，Cd2+在最终反应体系中的浓度为10-1～10-6M；当上述反应结束后，整个混合溶液将在100℃下回流1分钟～8天，通过对回流时间的控制可以控制微粒尺寸的增长，从而在500nm-680nm范围内实现对荧光发射峰位的调控，待溶液的荧光发射强度和发射峰位达到了实际应用的要求便可以将所得的纳米微粒溶液降至室温，这样便得到了表面修饰有不同数量胺基的CdTe荧光纳米微粒。具体合成路线如下CdTe-NH2(1)CdTe-NH2表面修饰有胺基的CdTe纳米微粒；b∶a＝0-100∶1；HSRNH2详见上分子式；HSR(CH2X)mY∶R＝(CH2)n，m＝1-10；n＝1-10；X，Y＝-OH，-COOH，-SH，H，-CH3；Cd2+∶Te2-∶HSR’＝1∶(0.1-0.8)∶(0.5-10)2.荧光CdTe纳米微粒的表面化学和生物化学修饰利用微粒表面的胺基进行化学和生物化学修饰，得到可以与生物体系进行特异性识别的纳米微粒荧光探针，附图1是表面修饰有抗体的CdTe纳米微粒荧光探针的结构示意图，具体修饰路线如下(2)耦联剂戊二醛及其它常用生物耦联剂；生物分子抗体、低分子量单链DNA、RNA、生物素(biotin)、抗原、蛋白等。3.复合有CdTe纳米微粒的荧光微球的制备，微球的荧光发光性质由微球中荧光微粒的性质及不同种类的荧光微粒的配比决定。1)用不同种类的表面活性剂将用上述方法制备的水溶性荧光纳米微粒萃取到油溶性聚合物单体溶液中，采用乳液聚合的方法得到可以在水中分散的荧光微球，具体的制备过程如下聚合物单体含有乙烯基团的化合物如苯乙烯、丙稀酸酯等；表面活性剂阳离子表面活性剂如含有长烷基链的季铵盐、阴离子表面活性剂如十二烷基苯磺酸钠等、及不同种类的非离子型表面活性剂等；2)用水解有机硅氧烷的方法(St_ber方法)制备含有荧光纳米微粒的二氧化硅微球。最终得到的荧光微球的尺寸在30纳米-1000纳米范围内。具体的制备过程如下硅烷化试剂含有三官能度或四官能度的有机硅氧烷；催化剂无机酸碱等。4.用不同方法将上述微球表面进行化学和生物化学修饰微球表面的化学和生物化学修饰的目的是得到可以与生物体系进行特异性识别的功能。微球表面的化学和生物化学修饰可以采用以下方法1)如采用带有胺基或巯基的三-甲或乙氧基硅烷来修饰二氧化硅的微球表面，再用通用的生物耦联方法将生物基团修饰到微球表面，得到可与生物体系进行特异性识别的微球荧光探针。(6)表面修饰剂含有有机官能基团的硅烷化试剂如三-甲氧基(乙氧基)-1-胺丙基(1-胺丁基、1-胺戊基、1-巯基丙基、1-巯基丁基、1-巯基戊基等)等；官能团巯基、胺基、羧基等；耦联剂戊二醛及其它常用生物耦联剂；生物分子抗体、生物素或低分子量的单链DNA、RNA、蛋白等。2)通过静电吸附的方法将联接有生物分子的聚电解质(如polyethylenimine)直接吸附到由乳液聚合方法或水解硅氧烷方法得到的荧光微球的表面，得到可以对生物体系进行识别的微球荧光探针。(7)聚电解质-生物分子如Polyethylenimine-生物分子等。生物分子抗体、生物素或低分子量的单链DNA、RNA、蛋白等。5.将上述方法制备的微粒或微球荧光探针用于生物检测纳米微粒和微球荧光探针可以用于免疫检测、多基因染色体组分析、蛋白芯片的联合检测、DNA测序、基因芯片及细胞或生物组织内不同区域的荧光同步检测中。微球荧光探针可以用于高灵敏度的免疫检测，具体作法是用修饰有抗体的基片作为检测载体，将基片先后浸入待测溶液和荧光探针溶液中，当待测溶液中有抗原出现时，微球荧光探针会自动通过抗体-抗原的特异性识别作用吸附到固体基片表面，使固体基片产生荧光。由于微球中含有大量的荧光微粒，微球荧光探针的使用将大大地提高免疫检测的灵敏度。用方法上述制备的纳米微粒和微球生物荧光探针具有下列优点1)同TOPO方法相比，采用巯基稳定剂在水中直接制备荧光CdTe纳米微粒，其制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种碲化镉荧光纳米微粒的制备，其特征在于，按如下方法：用含有胺基的水溶性巯基胺化合物，或含有一定比例的巯基胺与巯基乙酸、巯基丙酸、１－巯基甘油、１，２－二巯基甘油或巯基乙醇的混合物作为稳定剂，在水溶液中直接合成表面修饰有胺基的ＣｄＴｅ荧 光发光的纳米微粒；其中巯基胺与上述不含胺基的巯基化合物的比例为１∶０－１００；Ｃｄ↑［２＋］来源于水溶性的镉离子化合物；碲来源于不同方法制备的ＮａＨＴｅ或Ｎａ↓［２］Ｔｅ的水溶液；反应的投料比为Ｃｄ↑［２＋］∶Ｔｅ↑［２－］∶ＨＳＲ＝１∶（０．１－０．８）∶（０．５－１０），ＨＳＲ代表含有不同官能团的巯基化合物的总摩尔数，Ｃｄ↑［２＋］在与ＮａＨＴｅ或Ｎａ↓［２］Ｔｅ反应前先与巯基化合物混合，其混合溶液的ｐＨ通常在５－１１．５之间，ＮａＨＴｅ或Ｎａ↓［２］Ｔｅ溶液通过滴加方式加入到Ｃｄ↑［２＋］和ＨＳＲ混合溶液中，Ｃｄ↑［２＋］在最终反应体系中的浓度为１０↑［－１］～１０↑［－６］Ｍ，当上述反应结束后，整个混合溶液将回流１分钟～８天，得到ＣｄＴｅ荧光纳米微粒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高明远，
申请(专利权)人：高明远，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]