NTDs鼠胚动物模型及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种NTDs鼠胚动物模型及其构建方法，对孕6～10天的正常孕鼠一次性给予剂量19～23mg/kg的维甲酸进行灌胃干预，能够在孕10.5天后快速诱导构建稳定高效的NTDs鼠胚动物模型，进一步分离鼠胚脑泡组织细胞培养，还可以建立NTDs细胞模型。利用本发明专利技术构建的动物模型和细胞模型，可以在体内和体外为研究NTDs的分子和细胞机制提供良好的平台。

NTDs mouse embryo animal model and its construction method

The invention discloses a NTDs animal model of rat embryo and its construction method of pregnancy 6 ~ 10 days of normal pregnant rats given a one-time dose of 19 ~ 23mg/kg retinoic acid administered intervention, to quickly build NTDs rat embryo induced animal model of stable and efficient in pregnant 10.5 days, further away from rat embryonic cerebral vesicle tissue cell culture, can also establish NTDs cell model. The animal models and cell models constructed in this study can provide a good platform for studying the molecular and cellular mechanisms of NTDs in vivo and in vitro.

【技术实现步骤摘要】
NTDs鼠胚动物模型及其构建方法
本专利技术涉及一种动物模型的构建方法，特别是涉及一种NTDs鼠胚动物模型的构建方法，以及利用该方法构建的NTDs鼠胚动物模型和细胞模型。
技术介绍
神经管畸形(neuraltubedefects,NTDs)是人类最主要的出生缺陷疾病，发病率排在第二位。NTDs是由于在胚胎发育过程中，神经管闭合不全引起的一类先天畸形，主要表现是脑和脊髓的异常，临床上以先天性无脑畸形和脊柱裂常见，但其发病机制尚不清楚。全球有每年300000新生儿罹患，发病率约为0.5～2‰。发展中国家发病率更高，在山西省的某些地区高达13.9‰，严重影响人口质量的同时，也给社会和家庭带来了沉重的负担。神经管发生是胚胎早期一个重要的涉及中枢神经系统原基形成的发育学事件，从单侧神经上皮细胞构成的神经板逐渐演变为长管状神经管的过程称为神经胚形成。神经管闭合包含四个有序而重叠的阶段，即神经板形成、神经板塑形、神经板卷褶和神经褶融合，其中任何一个环节受到干扰，都会导致NTDs的发生。人NTDs标本来源有限，构建NTDs动物模型有助于深入认识人类NTDs的病因、发病机制和病理特点，对研究防治措施具有重要意义。鼠类与人的神经管发育模式非常相似，所以是目前研究NTDs最常见的模式生物。NTDs是遗传和环境因素共同作用的结果。现有NTDs动物模型的构建方法主要包括基因敲除和环境诱导两种方式。目前在小鼠中已经发现了超过200个基因可导致NTDs表型，但这些基因在人群中却没有得到很好的验证。环境因素对于神经管闭合具有深远的影响，叶酸能有效预防NTDs就是很好的证据。但近年来研究发现，30～50%的NTDs是不能通过叶酸来预防的。因此，其他的环境因素也应该引起重视。目前已构建了妊娠期高温、高糖以及一些化学因素(如顺铂、环磷酰胺、丙戊酸等)诱导的NTDs鼠胚模型，以用于NTDs发病机制的研究。由于环境因素复杂多样，研究不同环境对于NTDs发生的影响具有重要意义。维生素A在女性生殖和胚胎发育中具有重要作用，其在NTDs发生中的作用及机制值得探讨，建立相应的NTDs模型，将会为相关研究提供良好的平台。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种NTDs鼠胚动物模型及其构建方法，以利用所构建的鼠胚动物及细胞模型深入研究NTDs的发生机制。本专利技术具体是提供了一种采用维甲酸干预以构建NTDs鼠胚动物模型的方法。维甲酸是维生素A在体内的活性衍生物，其在体内的分布对胚胎发育具有重要的调节作用。维甲酸代谢紊乱可以引起鼠胚发育异常，本专利技术发现，维甲酸干预能够快速诱导构建稳定高效的NTDs鼠胚动物模型。本专利技术所述NTDs鼠胚动物模型的构建方法是：使用正常孕鼠，在孕6～10天时一次性给予剂量19～23mg/kg的维甲酸进行灌胃干预，孕10.5天后得到NTDs鼠胚动物模型。进一步地，所述维甲酸的最佳干预剂量为21mg/kg。孕6～10天是鼠胚神经管发育的关键阶段，在这个阶段，以合理剂量的维甲酸进行干预，能够成功得到NTDs鼠胚动物模型。优选地，构建NTDs鼠胚动物模型的最佳维甲酸干预时间是孕7.5天。本专利技术将小鼠按照一定的雌雄比例合笼得到孕鼠后，采用上述方法进行维甲酸药物干预，并以采用等体积香油干预的孕鼠作为对照。规定孕周时在体视显微镜下观察鼠胚发育情况，对照孕鼠鼠胚发育正常，药物干预孕鼠的鼠胚发育异常，出现明显的发育迟缓、神经管闭合障碍，主要表现为脑部畸形。证明本专利技术方法能够快速稳定的构建成功NTDs鼠胚动物模型。进而，本专利技术还在NTDs鼠胚动物模型的基础上，进一步分离出鼠胚脑泡组织进行细胞培养，建立了NTDs细胞模型，并对其细胞增殖、细胞周期和细胞分化等特性进行了研究。利用本专利技术所构建的动物模型和细胞模型，可以为研究NTDs的分子和细胞机制提供良好的平台。神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)具有增殖和自我更新能力，在特定条件诱因下，能够向各种类型神经元或神经胶质细胞分化，是神经系统形成和发育的基础，其增殖、凋亡和分化对于神经管的发育非常重要。本专利技术发现，维甲酸干预孕鼠的鼠胚发育过程中，可以引起鼠胚神经干细胞增殖及向神经元和神经胶质细胞的分化能力受损。本专利技术进一步发现，Nr2e1基因是孤儿核受体家族成员，主要在脑中表达，其异常表达可以导致小鼠视网膜和脑部发生异常。基于本专利技术建立的NTDs鼠胚动物模型和细胞模型，对Nr2e1基因在NTDs发生中的作用机制进行了研究，表明Nr2e1可通过影响NSCs的增殖和分化参与维甲酸诱导的NTDs发生过程，为探讨NTDs的发病机制提出了新的思路。附图说明图1是体视显微镜下观察正常与NTDs鼠胚的胎鼠形态及神经管发育情况。A：正常鼠胚；B：NTDs鼠胚，后脑未闭合；C：NTDs鼠胚，后脑未闭合合并胸腰段脊柱裂；D：NTDs鼠胚，全脑未闭合。图2是正常与NTDs鼠胚NSCs的形态学比较(标尺长度20μm)。图3是正常与NTDs鼠胚NSCs的免疫荧光法鉴定(标尺长度20μm)。图4是集落计数法和CCK-8法检测正常与NTDs鼠胚NSCs的增殖能力。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图5是流式细胞仪检测正常与NTDs鼠胚NSCs的细胞周期情况。A：Con组NSCs的细胞周期图；B：NTDs组NSCs的细胞周期图；C：处于G1、S和G2期的细胞数比较。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图6是免疫荧光法检测正常与NTDs鼠胚NSCs的细胞分化能力。NF-H代表向神经元分化能力，Gfap代表向星形胶质细胞分化能力。图7是原位杂交和RT-PCR法检测Nr2e1基因在正常与NTDs鼠胚中的表达情况。A：全胚胎原位杂交检测Nr2e1基因的表达，A1、A2、A3分别代表E8.5d、E9.5d和E10.5d的正常胚胎，B1、B2、B3分别代表E8.5d、E9.5d和E10.5d的NTDs胚胎(箭头所指为Nr2e1表达部位)；B：RT-PCR检测Nr2e1基因的表达，Actb作为内参。*P<0.05，**P<0.01。图8是RT-PCR和Westernblot法检测Nr2e1基因在正常与NTDs鼠胚NSCs中的表达情况。A：RT-PCR检测Nr2e1在两种NSCs中的mRNA水平表达，Actb作为内参；B：Westernblot检测Nr2e1在两种NSCs中的蛋白水平表达，β-actin作为内参。*P<0.05。图9是RT-PCR和Westernblot法检测Nr2e1shRNA对NSCs的转染效果。A：荧光显微镜下观察LV3-Nr2e1shRNA质粒转染效果，LV3-NCshRNA作为阴性对照，绿色荧光显示转染成功的细胞(标尺长度50μm)；B：RT-PCR检测LV3-Nr2e1shRNA转染NSCs后Nr2e1的mRNA水平表达，Actb作为内参；C：Westernblot检测LV3-Nr2e1shRNA转染NSCs后Nr2e1的蛋白水平表达，β-actin作为内参。*P<0.05。图10是抑制Nr2e1基因表达对NSCs增殖和分化的影响。A：LV3-Nr2e1shRNA转染NSCs后集落形成情况，随机计数5个视野；B本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种NTDs鼠胚动物模型构建方法，是对孕6～10天的正常孕鼠一次性给予剂量19～23mg/kg的维甲酸进行灌胃干预，在孕10.5天后得到NTDs鼠胚动物模型。

【技术特征摘要】
1.一种NTDs鼠胚动物模型构建方法，是对孕6～10天的正常孕鼠一次性给予剂量19～23mg/kg的维甲酸进行灌胃干预，在孕10.5天后得到NTDs鼠胚动物模型。2.根据权利要求1所述的NTDs鼠胚动物模型构建方法，其特征是所述维甲酸的干预剂量为21mg/kg。3.根据权利要求1所述的NTDs鼠胚动物模型构建方法，其特征是所述维甲酸干预时间为孕7.5天。...

【专利技术属性】
技术研发人员：解军，于娟，李仁科，张霆，徐钧，刘志贞，杨丽红，刘丹，靳宁，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：山西,14