一种艾美耳球虫冻存剂及冻存方法技术

本发明专利技术涉及一种艾美耳球虫冻存剂，所述冻存剂中包括冻存液和冷冻保护剂；所述冻存液中包括蔗糖、磷酸二氢钾、三水合磷酸氢二钾、L‑谷氨酸和小牛血清蛋白；所述冷冻保护剂为二甲基亚砜单体或包括二甲基亚砜的组合物。上述的冻存剂可分别制备成适用于孢子囊和卵囊冻存的冻存剂。采用本发明专利技术的冻存剂可将艾美耳球虫在液氮中长期进行保存，解决了艾美耳球虫需不断传代保种的不便。

A method for cryopreservation and cryopreservation of Eimeria tenella

The invention relates to a Eimeria cryopreservation agent, the cryopreservation agent including frozen liquid and cryoprotectant; the frozen liquid including sucrose, potassium dihydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate trihydrate, two L glutamic acid and bovine serum protein; the cryoprotectant for two single methyl sulfoxide the body includes two or dimethyl sulfoxide composition. The above freezing agents can be prepared into freeze-dried agents suitable for cryopreservation of cysts and oocysts respectively. The cryopreservation agent of the present invention can preserve Eimeria in liquid nitrogen for a long time, and solves the inconvenience of continuous breeding and preservation of eimeria.

【技术实现步骤摘要】
一种艾美耳球虫冻存剂及冻存方法
本专利技术属于低温冻存研究领域，具体的涉及一种应用于艾美耳球虫的低温长期保存的冻存液。
技术介绍
液氮温度(-196℃)是目前最佳冷冻保存温度。在-196℃时细胞生命活动几乎停止，但复苏后细胞结构和功能完好。有报道，人红细胞在液氮中保存12年仍未表现出明显的生理和生化功能的改变；胚脑细胞冻存在液氮中1年以后再复苏仍能保持生长和分化的特性。如果冷冻过程得当，一般生物样品在-196℃均可保存10年以上。艾美耳球虫是一种常见的原虫，其感染鸡、兔、牛、羊等动物而造成的球虫病对养殖业带来巨大的经济损失,因而研究艾美耳球虫的生物学、疫苗及抗球虫药物具有重要的生产实践意义。球虫研究中需要获得大量的球虫病原体并能在实验室长期保存。因此，能否找到一种合适的冻存液而充分利用液氮长期保存的能力实现艾美耳球虫长期的超低温冻存，是艾美耳球虫研究者一直关注的问题。目前，艾美耳球虫传统的保存方法即4℃低温保存。较常用的球虫保存液有两种：2.5％的重铬酸钾溶液，0.1mM的硫代硫酸钠溶液——前者用于保存具有感染性的孢子化卵囊，后者则用于较短时间保存未孢子化卵囊。保存时，向纯化好的孢子化卵囊中加入2.5％的重铬酸钾溶液(卵囊的最终浓度不超过1×106/ml)，置于4℃冰箱中即可。将孢子化卵囊置于2.5％的重铬酸钾溶液中，2-8℃条件下，虫体的感染性可保持1年左右。如果需要活力较高的虫体，保存时间则不超过3个月。因此在研究过程中，球虫需经常传代，既费时费力又容易造成污染。因此急需一种新型的艾美耳球虫保存方法来避免这一缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种适用于艾美耳球虫的冻存剂，所述冻存剂中包括冻存液和冷冻保护剂；所述冻存液中包括蔗糖、磷酸二氢钾、三水合磷酸氢二钾、L-谷氨酸和小牛血清蛋白；所述冷冻保护剂为二甲基亚砜单体或包括二甲基亚砜的组合物。优选的，每升所述的冻存液中，包括蔗糖70～80g；磷酸二氢钾0.2～0.7g；三水合磷酸氢二钾1～2g；L-谷氨酸0.6～1.2g；小牛血清蛋白5～15g。更优选的，每升所述的冻存液中，包括蔗糖73～76g；磷酸二氢钾0.4～0.6g；三水合磷酸氢二钾1.5～1.7g；L-谷氨酸0.8～1.2g，小牛血清蛋白9～11g。最优选的，每升所述的冻存液中，包括蔗糖74.6g；磷酸二氢钾0.5g；三水合磷酸氢二钾1.6g；L-谷氨酸0.9g，小牛血清蛋白10g。作为本申请最优选的实例，每升所述的冻存液中，包括蔗糖74.6210g；磷酸二氢钾0.5171g；三水合磷酸氢二钾1.6335g；L-谷氨酸0.9079g，小牛血清蛋白10.0000g。优选的，所述二甲基亚砜单体在所述冷冻保护剂中的体积分数为7～9％。这种冻存剂适用于孢子囊的冻存。本申请中的二甲基亚砜单体即为二甲基亚砜。利用上述的冻存剂对艾美耳球虫的孢子囊进行冻存的过程中，将孢子囊以2×106个/mL～3×106个/mL的浓度悬于所述的冻存剂中，然后再转入液氮中进行冻存。优选的，所述包括二甲基亚砜的组合物为二甲基亚砜和甘油的组合物。优选的，所述二甲基亚砜在所述冻存剂中的体积分数为7～10％，所述甘油在所述冻存剂中的体积分数为9～14％。这种冻存剂适用于卵囊的冻存。利用上述的冻存剂对艾美耳球虫的卵囊进行保护的方法，冻存的过程中，将卵囊以1×105～3×106个/mL的浓度悬于上述的冻存剂中，然后再转入液氮中进行冻存。上述方法中，将卵囊或孢子囊悬于冻存剂中后，将上述悬有卵囊或孢子囊的冻存剂装入冻存盒，放入-80℃的冰箱至少5h后，转入液氮保存。作为一种优选方案，本专利技术所述的冻存剂包括冻存液和二甲基亚砜。所述二甲基亚砜占所述冻存剂总体积的7-10％，所述冻存液占冻存剂总体积的90-93％。每升所述的冻存液中，包括蔗糖74.6g；磷酸二氢钾0.5g；三水合磷酸氢二钾1.6g；L-谷氨酸0.9g，小牛血清蛋白10g；利用上述的冻存剂对孢子囊进行冻存的方法包括如下步骤：1)将孢子囊以2×106个/mL～3×106个/mL的浓度悬于所述的冻存剂中；2)将上述悬有孢子囊的冻存剂装入冻存盒，放入-80℃的冰箱至少5h后，转入液氮保存。作为另一种优选方案，本专利技术所述的冻存剂包括冻存液、二甲基亚砜和甘油；所述二甲基亚砜占所述冻存剂总体积的7-10％，所述甘油占所述冻存剂总体积的9-14％，剩余为冻存液。每升所述的冻存液中，包括蔗糖74.6g；磷酸二氢钾0.5g；三水合磷酸氢二钾1.6g；L-谷氨酸0.9g，小牛血清蛋白10g；利用上述的冻存剂对卵囊进行冻存的方法包括如下步骤：1)将卵囊以1×105～3×106个/mL的浓度悬于所述的冻存剂中；2)将上述悬有卵囊的冻存剂装入冻存盒，放入-80℃的冰箱至少5h后，转入液氮保存。本专利技术的另一目的是保护本专利技术所述的冻存液在艾美耳球虫冻存中的应用。优选的，本专利技术所述的冻存液在冻存禽类艾美耳球虫或哺乳类艾美耳球虫中的应用。本专利技术所述的卵囊在进行冷冻前需进行如下的纯化预处理：1)取略高于所需卵囊量的孢子化卵囊液(纯化有损失，可按回收率为50％计算)离心沉淀(3600rpm,5min*)；2)加3～5倍沉淀体积的饱和盐水重悬沉淀，离心，吸取含卵囊的上层液体(3600rpm,5min*)；3)加至少5倍上层液体的蒸馏水离心沉淀卵囊(3600rpm,5min*)；4)加3-5倍沉淀体积的次氯酸钠溶液(有效氯浓度≥6.25％)重悬沉淀，冰浴5min(期间摇匀2-3次)，离心(3600rpm,5min*)，上清转移至新的离心管；5)加至少5倍上清体积的蒸馏水离心沉淀卵囊(3600rpm,5min*)，重复3次以上至离心管中无明显“消毒液”气味，所得沉淀用重铬酸钾溶液或PBS溶液重悬(卵囊在PBS溶液中，4℃条件下可保存数周，长时间保存建议使用重铬酸钾溶液保存)计数后进行进一步操作或保存于4℃，备用。本专利技术所述的孢子囊由卵囊破壁得到，具体的，破壁的操作主要包括如下两种：A玻璃珠震荡法1)卵囊沉淀加入1-3mlPBS混匀后与玻璃珠按1:1混合于15ml离心管，于涡旋振荡器上破碎卵囊壁(限鸡球虫，鼠球虫和兔球虫可用1mm玻璃珠震荡)；期间取1微升研磨物不时镜检，镜检90％左右卵囊破碎时停止。2)用移液器将孢子囊悬液(含有少量卵囊、卵囊残壁)从15ml离心管(含玻璃珠和孢子囊等混合液)中转移到10ml离心管[具体操作：用移液器吸取上层液体转移到10ml离心管中，再加1ml左右PBS吹吸，洗去玻璃珠间的破碎物，重复3次，离心沉淀(2500rpm,5min*)]；3)用10mlPBS离心沉淀(2500rpm,5min*)，重复2次后转移到1.5ml离心管。B研磨器研磨法1)卵囊沉淀加入1ml高压过PBS,混匀后加入到高压过的研磨器中进行研磨，从研磨器中取1微升研磨物不时镜检，镜检90％左右卵囊破碎时停止；2)将孢子囊悬液(含有少量卵囊、卵囊壁)从研磨器中转移到10ml离心管(2-3mlPBS清洗研磨器)，离心沉淀(2500rpm,5min*)；3)用10mlPBS重悬，离心沉淀(2500rpm,5min*)，重复两次，转移到1.5ml离心管。此步骤中所使用的玻璃珠震荡法破碎卵囊壁与研磨器研磨法相比均能达到较好的物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种艾美耳球虫冻存剂，其特征在于，所述冻存剂中包括冻存液和冷冻保护剂；所述冻存液中包括蔗糖、磷酸二氢钾、三水合磷酸氢二钾、L‑谷氨酸和小牛血清蛋白；所述冷冻保护剂为二甲基亚砜单体或包括二甲基亚砜的组合物。

【技术特征摘要】
1.一种艾美耳球虫冻存剂，其特征在于，所述冻存剂中包括冻存液和冷冻保护剂；所述冻存液中包括蔗糖、磷酸二氢钾、三水合磷酸氢二钾、L-谷氨酸和小牛血清蛋白；所述冷冻保护剂为二甲基亚砜单体或包括二甲基亚砜的组合物。2.根据权利要求1所述的冻存剂，其特征在于，每升所述的冻存液中，包括蔗糖70～80g；磷酸二氢钾0.2～0.7g；三水合磷酸氢二钾1～2g；L-谷氨酸0.6～1.2g；小牛血清蛋白5～15g。3.根据权利要求1所述的冻存剂，其特征在于，每升所述的冻存液中，包括蔗糖73～76g；磷酸二氢钾0.4～0.6g；三水合磷酸氢二钾1.5～1.7g；L-谷氨酸0.8～1.2g，小牛血清蛋白9～11g。4.根据权利要求1～3任一项所述的冻存剂，其特征在于，所述二甲基亚砜单体在所述冷冻保护剂中的体积分数为7～9％。5.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：索勋，刘贤勇，段春慧，索静霞，向碧琪，郝振凯，韩贞艳，毕菲菲，陶鸽如，李超，张思新，王超越，顾小龙，汤新明，胡丹丹，于咏兰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11