一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法技术

本发明专利技术公开一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法。本发明专利技术所述方法检测时间短，整个检测过程仅需5min左右，且检测灵敏度最低可达到10ng/mL。本发明专利技术所述方法可同时进行批量样本的检测，最多一次可进行80个样品的检测，而整个时间仅有30min，实现高通量样品快速检测。本发明专利技术所述方法中的光纤传感器可通过再生过程重复使用，大大降低的检测的成本。

A method of methadone detection based on biofilm interference technique

The invention discloses a method for detecting methadone based on biomembrane interference technology. The detection time of the method is short, the whole detection process needs only about 5min, and the detection sensitivity can reach 10ng/mL at least. The detection method of the invention can be batch samples at the same time, detection at a time can be carried out in 80 samples, and the whole time is only 30min, to achieve rapid detection of high throughput sample. The optical fiber sensor in the method can be reused by the regeneration process, which greatly reduces the detection cost.

【技术实现步骤摘要】
一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法
本专利技术属于毒品检测领域，尤其是批量样本检测领域，涉及一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法。
技术介绍
盐酸美沙酮(简称美沙酮)为μ阿片受体激动剂，药效与吗啡类似，具有镇痛作用，并可产生呼吸抑制、缩瞳、镇静等作用。不良反应主要有头痛、眩晕、恶心、出汗、嗜睡、欣快(过量时)、便秘、体位性低血压；具有成瘾性，长期使用应注意组织蓄积产生的过量中毒以及导致的药物依赖(主要为身体依赖)，美沙酮导致的药物依赖属中度至重度，表现为突然停药后出现阿片戒断症状；长期使用美沙酮的妊娠妇女，娩出的新生儿可出现戒断综合征，表现为震颤、肌肉强直、烦躁不安(啼哭)、呵欠、喷嚏、呕吐、腹泻等，可采取镇静和对症治疗。美沙酮过量可导致呼吸抑制，呼吸抑制主要表现为昏迷、呼吸变浅变慢，瞳孔缩小呈针尖状(严重呼吸抑制可因脑缺氧而散大)，血压下降，甚至休克，严重者可因呼吸抑制而死亡。目前美沙酮的检测方法主要为胶体金法和色谱法。胶体金试纸条虽然检测方便，但其以吸毒人员尿液为检测对象，其灵敏度只有几百ng/ml，且每个试纸条每次只能检测一个人。色谱法虽然灵敏度高，但前处理过程时间较长，需要专门技术人员和大规模昂贵仪器。而本技术以其高灵敏度，可实现对待检人员的唾液进行毒品检测，从而避免因取尿对客体隐私的侵犯，并可实现在几分钟内进行80个样品的高通量检测。生物膜干涉技术生物膜干涉技术(Bio-1ayerinterferometry，BLI)是一种实时、无需标记的快速检测技术，其原理是当生物分子结合到传感器表面形成一层生物膜层，该生物膜层对透过传感器的光的波形造成干涉现象。干涉现象以相位移动的方式被检测，可以检测结合到传感器分子数量的变化。BLI技术已经成功应用于蛋白质分子间相互作用的检测，在小分子检测领域也有进一步研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速、高通量的检测待检人员唾液中美沙酮含量的技术。所述检测方法取样方便，操作简单，检测快速，灵敏度高，在批量样品检测场合具有重要的应用价值。本专利技术的目的由以下技术方案实现：一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法，包括如下步骤：步骤(1)：胶体金的制备。取一定体积的氯金酸HAuCl4水溶液加热煮沸，再按100:1的体积比加入枸橼酸三钠水溶液，继续加热煮沸5min，直至溶液呈橙红色，采用分光光度计检测520-530nm处的吸光度；所述的氯金酸溶液的质量分数为0.01％，枸橼酸三钠水溶液的质量分数为1％；所述的上述过程都是避光的；本方法所述的胶体金的粒径为30-40nm，在524nm波长下有最大吸光度值；步骤(2)：金标抗体的制备。取一定体积的胶体金溶液,用碳酸钾溶液调节PH至7.2-7.4，室温搅拌10-20min；按100:1-2的体积比加入1mg/mL的美沙酮单克隆抗体,室温搅拌20-30min；加入质量分数为10％的BSA溶液使其终浓度为1％,室温搅拌20-30min；4-8℃，12000rpm离心20-30min；弃上清液，留沉淀；沉淀用等体积的PBS缓冲液溶解，得到美沙酮金标抗体溶液；所述的胶体金溶液为步骤(1)检验合格的；碳酸钾溶液浓度为0.2M；美沙酮单克隆抗体为购买的鼠源单克隆抗体；BSA(牛血清白蛋白)溶液封闭抗体未结合的位置；PBS缓冲液的pH为7.4；步骤(3)：光纤生物传感器的制备。将APS光纤生物传感器的检测端浸没在美沙酮-BSA溶液中，室温静置20-30min；再将光纤生物传感器的检测端浸没在质量含量为10％的BSA溶液中，室温静置20-30min；再将光纤生物传感器的检测端浸没在蔗糖溶液中，室温静置20-30min；室温晾干，置于2～8℃干燥保存；所述的APS光纤传感器是用无水乙醇配置的0.5M的APS(Aminopropyls-ilane,氨基丙基硅烷)浸泡光纤探头12小时并干燥后制得的，处理后的光纤探头表面能通过蛋白的氨基固定蛋白分子；美沙酮-BSA为美沙酮完全抗原，即在BSA表面偶联了美沙酮分子，可购买获得；美沙酮-BSA溶液浓度为50-100μg/mL,蔗糖溶液浓度为15％(质量含量)；步骤(4)：待测样品准备。用棉签沾取待检人员下牙床内的唾液后，将棉签插入含有0.5-1mL溶液的EP管中并旋转混匀后弃掉棉签；EP管内的溶液待用；所述的棉签为医用一次性棉签，EP管内的溶液为步骤(2)制得的美沙酮金标抗体溶液，EP管内的溶液作为后续检测的样品；步骤(5)：标准曲线的制作。采用ForteBioOctetRed生物分子相互作用仪对梯度标准品溶液进行检测，绘制标准曲线；具体过程为①8个步骤(3)制备的光纤传感器没入PBS缓冲液中30-100s进行平衡，②平衡后的8个光纤传感器分别没入0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的美沙酮标准品溶液中60-100s进行梯度标准品的检测，根据检测结果，绘制标准曲线，再对标准品浓度做10为底的对数转换，得出标准品浓度和检测信号之间的函数关系，③梯度标准品检测后的8个光纤传感器没入甘氨酸-盐酸缓冲液中30-100s进行再生，④再生后的光纤传感器再没入PBS缓冲液中30-100s进行平衡；所述的具体过程可通过操作软件设置后仪器自动操作进行；甘氨酸-盐酸缓冲液的pH为1.5-2；光纤传感器经过再生后可重复使用；步骤(6)：样品检测。采用ForteBioOctetRed生物分子相互作用仪对步骤(4)的样品进行检测；检测过程为①步骤(5)平衡后的光纤传感器没入步骤(4)的样品中60-100s进行检测，②检测后的光纤传感器没入甘氨酸-盐酸缓冲液中30-100s进行再生，③再生后的光纤传感器再没入PBS缓冲液中30-100s进行平衡；将检测结果代入步骤(5)的函数中，求得样品中美沙酮的浓度。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术所述方法取样方便，避免检测人员在尿液取样中的不便和对待测人员隐私的侵犯。(2)本专利技术所述方法检测时间短，整个检测过程仅需5min左右，且检测灵敏度最低可达到10ng/mL。(3)本专利技术所述方法可同时进行批量样本的检测，最多一次可进行80个样品的检测，而整个时间仅有30min，实现高通量样品快速检测。(4)本专利技术所述方法中的光纤传感器可通过再生过程重复使用，大大降低的检测的成本。附图说明图1为制备的胶体金的吸光度检测结果。图2为8个梯度标准品的检测结果。图3为8个梯度标准品的标准曲线。具体实施方式下面结合实施例和附图来详述本专利技术，但不限于此。以下实施例中提到的主要试剂信息见表1；主要仪器与设备信息见表2。表1表2实施例1：(1)取100mL质量分数为0.01％的氯金酸水溶液置于烧杯内，加热煮沸，加入1mL质量分数为1％枸橼酸三钠水溶液，继续加热煮沸5min，直至溶液呈橙红色，采用分光光度计检测520-530nm处的吸光度,制备的胶体金的吸光度如图1所示，表明制备的胶体金的直径在30nm左右；(2)取胶体金溶液100ml,用碳酸钾溶液调节PH至7.2，室温搅拌10min；加入1mg美沙酮单克隆抗体,室温搅拌20min；加入2mlBSA溶液封闭抗体,室温搅拌20min；4℃，12000rpm离心20本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤(1)、金标抗体的制备将胶体金溶液调节PH至7.2‑7.4，室温搅拌10‑20min；按100:1‑2的体积比加入1mg/mL的美沙酮单克隆抗体,室温搅拌20‑30min；加入质量分数为10％的BSA溶液使其终浓度为1％，室温搅拌20‑30min；然后置于4‑8℃下离心，沉淀用等体积的PBS缓冲液溶解，得到安非他命金标抗体溶液；所述的胶体金粒径为30‑40nm，在524nm波长下有最大吸光度值；步骤(2)、待测样品准备用棉签沾取待检人员下牙床内的唾液后，置于0.5‑1mL安非他命金标抗体溶液中，旋转混匀后弃掉棉签，得到所需的待测样品；步骤(3)、样品检测采用ForteBio Octet Red生物分子相互作用仪对步骤(2)的待测样品进行检测，检测过程如下：①将再生平衡后的APS光纤传感器的检测端浸没在步骤(2)的待测样品60‑100s进行检测；②检测后的APS光纤传感器的检测端再次进行再生平衡；③将检测结果代入美沙酮标准曲线中，获得待测样品中美沙酮的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤(1)、金标抗体的制备将胶体金溶液调节PH至7.2-7.4，室温搅拌10-20min；按100:1-2的体积比加入1mg/mL的美沙酮单克隆抗体,室温搅拌20-30min；加入质量分数为10％的BSA溶液使其终浓度为1％，室温搅拌20-30min；然后置于4-8℃下离心，沉淀用等体积的PBS缓冲液溶解，得到安非他命金标抗体溶液；所述的胶体金粒径为30-40nm，在524nm波长下有最大吸光度值；步骤(2)、待测样品准备用棉签沾取待检人员下牙床内的唾液后，置于0.5-1mL安非他命金标抗体溶液中，旋转混匀后弃掉棉签，得到所需的待测样品；步骤(3)、样品检测采用ForteBioOctetRed生物分子相互作用仪对步骤(2)的待测样品进行检测，检测过程如下：①将再生平衡后的APS光纤传感器的检测端浸没在步骤(2)的待测样品60-100s进行检测；②检测后的APS光纤传感器的检测端再次进行再生平衡；③将检测结果代入美沙酮标准曲线中，获得待测样品中美沙酮的浓度。2.如权利要求1所述的一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法，其特征在于所述的美沙酮标准曲线采用ForteBioOctetRed生物分子相互作用仪对梯度标准品溶液进行检测，绘制标准曲线，具体过程如下：①多个APS光纤生物传感器的检测端浸没在PBS缓冲液中30-100s进行平衡；②平衡后的多个光纤传感器的检测端分别浸没在0ng/mL、1...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚伟宣，王继业，吕云平，王学军，孟凡伟，
申请(专利权)人：浙江警察学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33