基于核酸层析生物传感技术检测产气荚膜梭菌的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于核酸层析生物传感技术检测产气荚膜梭菌的方法，根据产气荚膜梭菌的毒力基因cpa，设计环介导等温扩增引物(SEQ ID NO:1‑4)，结合纳米酶核酸试纸条，建立一种基于LAMP纳米酶传感器的产气荚膜梭菌检测方法。本方法可成功地用于区分活菌细胞和死菌细胞，对产气荚膜梭菌的检测下限可达10CFU/mL。

Nucleic acid chromatography based biosensing technique for detection of Clostridium perfringens

The invention relates to a method for nucleic acid chromatography biological sensing technology based on the detection of Clostridium perfringens, according to virulence gene CPA of Clostridium perfringens, design a loop mediated isothermal amplification primers (SEQ ID NO:1 4), combined with nano enzyme nucleic acid strip, to establish a LAMP method for detection of Clostridium perfringens. The enzyme sensor based on M. This method can be successfully used to distinguish viable and dead cells, and the detection limit of Clostridium perfringens can reach 10CFU/mL.

【技术实现步骤摘要】
基于核酸层析生物传感技术检测产气荚膜梭菌的方法
本专利技术涉及生物传感检测
，具体地说，涉及一种基于核酸层析生物传感技术检测产气荚膜梭菌的方法。
技术介绍
产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，造成组织大面积坏死。为革兰阳菌粗短大杆菌，大小(1～1.5)μm×(3～5)μm。两端钝圆，单个或成双排列，偶见链状。芽胞椭圆形，位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌体，在一般培养时不易形成芽胞，在无糖培养基中有利于形成芽胞。在机体内可产生明显的荚膜，无鞭毛，不能运动。产气荚膜梭菌既能产生强烈的外毒素，又有多种侵袭性酶，并有荚膜，构成其强大的侵袭力，引起感染致病。传统的细菌检测方法主要根据生理生化特征，但是传统的检测方法需要经过前增菌、选择性平板分离、生物化学鉴定等步骤，从取样到确定结果需要5-7天，检测周期长，操作繁琐，工作量大；利用抗原抗体反应的特异性，对细菌进行鉴别，已有了半个多世纪的历史，但是微生物抗体的筛选十分繁琐，并且最终的检测特异本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的LAMP引物组，其特征在于，包括：外侧正向引物F3：5’‑CTAGATATGAATGGCAAAGAGG‑3’；外侧反向引物B3：5’‑AGATATCAGCATAAAAATCCTCA‑3’；以及内侧正向引物FIP：5’‑GGCAGTAACATTAGCAGGATGATATTAAACAAGCTACATTCTATCTTGG‑3’；内侧反向引物BIP：5’‑TGATAGCGCAGGACATGTTAAGTTTGCAACCTGCTGTGTT‑3’；其中，引物FIP的5’端标记生物素，引物BIP的5’端标记荧光素FITC。

【技术特征摘要】
1.用于检测产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的LAMP引物组，其特征在于，包括：外侧正向引物F3：5’-CTAGATATGAATGGCAAAGAGG-3’；外侧反向引物B3：5’-AGATATCAGCATAAAAATCCTCA-3’；以及内侧正向引物FIP：5’-GGCAGTAACATTAGCAGGATGATATTAAACAAGCTACATTCTATCTTGG-3’；内侧反向引物BIP：5’-TGATAGCGCAGGACATGTTAAGTTTGCAACCTGCTGTGTT-3’；其中，引物FIP的5’端标记生物素，引物BIP的5’端标记荧光素FITC。2.一种纳米酶核酸层析试纸条，其特征在于，所述试纸条的制备方法包括以下步骤：1)Fe3O4磁颗粒的制备；2)纳米酶探针的制备：将Fe3O4磁颗粒与生物素二抗进行孵育，得到生物素二抗纳米酶探针；3)纳米酶核酸层析试纸条的组装：所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中，所述硝酸纤维素膜上设有至少1条检测线和1条质控线；所述结合垫上固定有生物素二抗纳米酶探针；①分别用FITC抗体和生物素抗体在硝酸纤维素膜上划出检测线和质控线，烘干；②将上述样品垫、结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜以及吸收垫依次粘贴在底板上，完成试纸条的组装。3.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，步骤1)中利用水热法合成Fe3O4磁颗粒，具体为：将0.6-0.8gFeCl3·6H2O溶解在20mL乙二醇中，然后加入1.5-2.0g醋酸钠，搅拌30-40min，然后密封在高压釜中，200℃加热16-18h；磁颗粒产物用乙醇洗涤，并在60℃下干燥；将二氯乙烷和N-羟基琥珀酰亚胺各5-8mg通过涡旋溶解在1mL去离子水中，制得混合液，然后将5-8mg磁颗粒加入混合液中，室温下孵育30-40min，然后用磁铁收集磁颗粒，用超纯水洗涤，即得Fe3O4磁颗粒。4.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于，步骤2)具体为：将浓度100μg/mL的生物素二抗加入50mMpH6.0的醋酸钠缓冲液中，然后与5-8mg的Fe3O4磁颗粒混合，将混合物涡旋混合，4℃孵育过夜；用pH7.0的PBS液洗涤混合物，然后在50mMpH7.2的Tris缓冲液中室温孵育30-40min；再用pH7.0的PBS液洗涤，即得到生物素二抗纳米酶探针。5.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，步骤2)和3)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗云波，许文涛，徐瑗聪，程楠，黄昆仑，张莉，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11