The invention relates to a hydrophobic protein N terminal based on enrichment method, including: protein free amino, closed strong hydrophobic groups, labeled affinity trapping reversed-phase materials. Free amino groups of protein samples first at the protein level by chemical modification of N closed end and side chain, then the protein was hydrolyzed, and the free amino groups of newly produced in non N terminal peptide of introducing strong hydrophobic groups, finally using reversed-phase materials with strong affinity removal of hydrophobic groups of non N terminal peptide, thereby N end peptide protein. The advantages of the invention are high labeling efficiency, high removal efficiency, high selectivity, simple processing steps, and reduced sample loss and non-specific adsorption.
【技术实现步骤摘要】
一种基于疏水基团修饰的蛋白质N-端富集方法
本专利技术涉及蛋白质N-端富集方法,即一种基于疏水基团修饰的蛋白质N-端富集方法,以实现蛋白N-端的高效高选择性富集。
技术介绍
蛋白质N末端的修饰是生物体内常见的翻译后修饰之一,常见的N端乙酰化与信号肽剪切与蛋白质的稳定性、定位及活性密切相关。此外,生物体内蛋白的降解与剪切加工是体内最常见的翻译后修饰之一,促使蛋白产生新的N末端,此类过程与细胞凋亡、趋化因子加工等众多生物学过程及生理机能密切相关。末端蛋白组学的建立也大大的促进了蛋白水解酶底物鉴定及位点分析等领域的发展。但是,生物样品中蛋白组分复杂,并且含量的动态分布范围宽,经过酶切后其复杂程度进一步增加,因此发展N末端肽段的富集方法,以提高N端肽段鉴定的覆盖度,对于了解生物过程及寻找疾病的生物标志物都起到重要作用。蛋白质末端的富集主要分为两大类,正向富集与反向富集。正向富集通常在蛋白质末端引入亲和标签,酶解后通过亲和标签实现蛋白质N端富集(Cell2008,134,866–876;AnalyticalChemistry2013,85,6826-6832;ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences2009,106,19310-19315),此类方法可实现蛋白质N端肽段的高选择性富集,但是通常在N端引入标签的效率低,限制了方法的富集效率。此外正向富集方法无法获得内源性修饰的N端肽段,而生物样品中,大于50%的蛋白的N端存在內源性的修饰,因此反向富集方法获得了广泛的关注。反相富集通过氨基活性材料或带有标签的氨基活性试剂去除中间 ...
【技术保护点】
一种基于疏水基团修饰的蛋白质N‑端富集方法,包括:封闭蛋白质上的自由氨基并酶解;非N端肽段修饰上强疏水基团;反相材料吸附带有强疏水基团的非N端肽段。
【技术特征摘要】
1.一种基于疏水基团修饰的蛋白质N-端富集方法,包括:封闭蛋白质上的自由氨基并酶解;非N端肽段修饰上强疏水基团;反相材料吸附带有强疏水基团的非N端肽段。2.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:1)采用氨基活性试剂封闭蛋白质上N端以及侧链的自由氨基;2)采用蛋白水解酶酶解蛋白质,产生不带有自由氨基的N端肽段,以及于N端暴露新的自由氨基的非N端肽段;3)采用带有碳链的氨基活性试剂作为强疏水基团标记非N端肽段;4)采用反相材料吸附标记碳链的非N端肽段。3.按照权利要求2所述的方法,其特征在于:1)所述的氨基活性试剂封闭蛋白质自由氨基,具体步骤如下:将蛋白质溶解于含2-8M盐酸胍pH为6-10的缓冲液中并进行变性、还原、烷基化,加入终浓度10-4000mM的氨基活性试剂,反应1-48h后,将溶液转移至3000-10000Da的超滤膜上,离心去除溶剂并采用pH为6-10的缓冲液清洗残余试剂后,将蛋白溶于pH为6-10的缓冲液中,得到溶液A;2)所述的蛋白水解酶酶解蛋白质,具体步骤如下:于所述的溶液A中加入蛋白水解酶进行酶解,蛋白水解酶酶用量为蛋白质质量的1/5-1/100,酶解时间为2-48h,酶解温度25-45℃,得到溶液B;3)所述的带有碳链的氨基活性试剂标记非N端肽段,具体步骤如下:于所述的溶液B中加入终浓度10-200mM带有碳链的氨基活性试剂和10-600mM氰基硼氢化钠,反应1-48h,反应温度25-70℃得到溶液C;4)所述的反相材料吸附标记碳链的非N端肽段,具体步骤如下:将所述的溶液C的溶剂进行挥发,采用上样溶液溶解后,上样到反相材料上,材料与蛋白质重量比为10-10000,将材料采用上样溶液清洗后,采用洗脱溶液洗脱N端肽段;按体积百分浓度计,上样溶液:2%乙腈+0.001%-2%三氟乙酸,其余为水;洗脱溶液:30%-80%乙腈+0.001%-2%三氟...
【专利技术属性】
技术研发人员:张丽华,陈玲凡,单亦初,杨开广,张玉奎,
申请(专利权)人:中国科学院大连化学物理研究所,
类型:发明
国别省市:辽宁,21
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