一种微量核酸释放剂、制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种微量核酸释放试剂，所述试剂由表面活性剂、氯化钾、蛋白酶K、牛血清白蛋白、氢氧化钠和水组成，所述微量核酸释放试剂可以从微量样本中快速释放DNA或RNA基因组，所述微量样本为全血、血浆、血清，咽试子洗脱液或分泌物，免去核酸回收等多项步骤，本发明专利技术能够快速进行核酸释放，并且不干扰后续的核酸检测结果，极大地提高了核酸检测的效率和准确性。

A micro nucleic acid releaser, preparation method and application thereof

The present invention provides a nucleic acid release reagent, the reagent by surfactant, potassium chloride, proteinase K, bovine serum albumin, sodium hydroxide and water, can quickly release reagent DNA is released from a small sample of RNA genome or the trace nucleic acid, the trace sample of whole blood, plasma, serum, pharyngeal specimen sub eluent or secretions from nucleic acid recovery and many other steps, the invention can release nucleic acid fast, and does not interfere with nucleic acid detection results of the follow-up, which greatly improves the efficiency and accuracy of nucleic acid detection.

【技术实现步骤摘要】
一种微量核酸释放剂、制备方法及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种微量核酸释放剂、制备方法及其应用。
技术介绍
自1985年PCR技术问世以来，这一技术已被广泛应用到生命科学各个领域，其特点是敏感性高、特异性强、操作简便、所需时间短等。由于临床或直接获得标本中含有蛋白质、脂类等可干扰PCR反应的物质，故在做PCR反应前必须进行核酸提取与纯化。PCR检测技术的第一步就是模板DNA/RNA的制备，这直接影响后续PCR反应的结果。一直以来，样本中核酸的提取和纯化是整个实验中最耗时，最繁琐的过程，严重影响样本检测的速度。样本中核酸的提取主要包括两个步骤：裂解细胞和提取核酸。裂解细胞使核酸从细胞中释放，蛋白解离的常用方法包括物理法(煮沸、冻融、微波、超声、研磨等)、化学方法(高盐、表面活性剂、苯酚等)和酶消化法(溶菌酶、蛋白酶K等)。苯酚-氯仿抽提法、异丙醇沉淀法及甲酰胺裂解法是提取DNA最为经典的方法，目前很多方法的改进都是在这些方法的基础上进行的，这三种方法均是利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)消化裂解细胞。在前两种方法中，裂解液先用苯酚-氯仿去除蛋白质，再分别用乙醇或异丙醇双醇沉淀DNA。甲酰胺法是利用高浓度的甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，然后利用透析来处理DNA样品。这些经典方法在不计样本量情况下获得的DNA纯度很高，能够满足各种试验的要求，但操作繁琐，用时长，且所用试剂具有一定的毒性。碱裂解法是在NaOH提供的高pH(12.0～12.6)条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使细胞的蛋白质发生变性，释放出DNA。裂解后，细胞壁碎片与变性的蛋白质和其他杂质形成大的复合物，这些复合物在高钾盐条件下，可有效沉淀，而DNA保留于上清液中，再通过无水乙醇沉淀、乙醇洗涤等步骤纯化DNA。碱裂解法虽然快速简便，但去蛋白效果欠佳，明显影响了后续PCR效果。煮沸裂解法原理，是在煮沸时将样品中的DNA通过含蛋白酶K等裂解缓冲液的作用释放出来，溶解在缓冲液中，沸水浴裂解细胞的同时，可破坏DNA链的碱基配对，并使细胞的蛋白质与染色体DNA变性。通过离心沉淀去除变性的蛋白质和其他杂质，然后回收上清液中的DNA用于PCR扩增。然而，经高温煮沸，蛋白凝固使部分核酸被包裹并随离心沉淀丢失，直接导致上清液中模板核酸量减少；另外，虽经煮沸并高速沉淀，上清液中仍含有少量抑制扩增的成分如蛋白、肝素及微量血红蛋白等，抑制了扩增效率。磁珠法是近几年才发展起来的核酸提取方法，磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒(即磁珠-DNA混合物)，再用洗脱液洗脱，得到纯净的DNA。由于其系列试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂，提取步骤更简单，对核酸样本的回收率高和纯度好等优势而倍受研究者青睐。不过产品基本上为国外所垄断，价格非常昂贵，从而限制了其在我国的广泛应用。目前，国内外临床应用于荧光定量PCR扩增核酸提取方法主要有：(1)碱裂解煮沸法，在样本中加入裂解液煮沸提取核酸；(2)硅胶膜吸附柱法，采用硅胶膜层析柱吸附、清洗、洗脱获得核酸；(3)磁珠吸附法，采用磁珠吸附、清洗、洗脱获得核酸。这三种方法都需要经过多步骤离心(或负压抽吸、磁棒分离)、换管或移液操作才能获得核酸，存在操作步骤繁多、过程中核酸容易丢失或污染的不足。因此由于临床上样本的量比较少，例如临床样本包括血液、唾液、擦拭物等，无法通过常规核酸提取方法得到符合要求的核酸，影响后续的核酸检测结果，因此迫切需要一种可以进行微量核酸释放的试剂，既可以灵敏地进行核酸的检测，又免去核酸的回收步骤，避免核酸丢失或污染。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术的目的提供了一种微量核酸释放剂，其中，所述核酸释放剂的各组分配比为：体积百分比0.2％～2.5％的表面活性剂、质量体积百分比0.5％～8％的氯化钾、质量体积浓度0.02mg/ml～1.5mg/ml的蛋白酶K、质量体积百分比0.5％～10％的牛血清白蛋白和2mg/ml～50mg/ml氢氧化钠，余量为水。其中表面活性剂Tween-20(聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯；吐温-20)。本专利技术是在经典碱裂解煮沸法的基础上，加入多项试剂优化而来的。经典碱裂解法可以释放大部分液体样本DNA，但有诸多缺点：1、裂解不够充分，如果低于1000拷贝/毫升DNA，样本无法得以有效裂解。2、反应后溶液pH值比较高，裂解液无法直接用作PCR模板。3、在碱性环境下，RNA极易水解，该方法不能用于提取RNA样本。因此本专利技术创新在于：1、加入蛋白酶K，可以在较高pH值条件下解离核酸结合蛋白，同时高温灭活蛋白酶K，不影响后续PCR实验。2、加入Tween-20表面活性剂，由于表面活性剂具有极性和非极性基团，可以很好的破膜作用，使核酸从包膜蛋白中释放，同时低浓度的Tween-20不会抑制后续PCR反应。3、加入适量的KCl盐，低盐浓度(<1mol/L)可以增加核酸在溶液中的溶解度。4、加入BSA，BSA是一种很好的稳定剂，同时能够保护核酸水解，结合螯合剂、血红素等抑制PCR反应的物质。5、本专利技术研究显示，合适的Tween-20和KCl浓度比例可以降低强碱和蛋白酶K对BSA的水解作用，合适浓度的Tween-20和KCl环境中，BSA可与NaOH和蛋白酶K稳定共存。本专利技术进一步提供了一种微量核酸释放剂，其中，所述核酸释放剂的各组分配比为：体积百分比0.5％～2％的表面活性剂、质量体积百分比1％～5％的氯化钾、质量体积浓度0.05mg/ml～1mg/ml的蛋白酶K、质量体积百分比1％～8％的牛血清白蛋白和5mg/ml～40mg/ml氢氧化钠，余量为水。本专利技术进一步提供了一种微量核酸释放剂，其中，所述核酸释放剂的各组分配比为：体积百分比0.5％～1.5％的Tween-20、质量体积百分比1.2％～3％的氯化钾、质量体积浓度0.1mg/ml～0.8mg/ml的蛋白酶K、质量体积百分比2％～6％的牛血清白蛋白和6mg/ml～30mg/ml氢氧化钠，余量为水。体积百分比％(v/v)，质量百分比％(w/v)本专利技术进一步提供了一种微量核酸释放剂，其中，所述核酸释放剂的各组分配比为：体积百分比0.6％～1.0％的Tween-20、质量体积百分比1.2％～1.75％的氯化钾、质量体积浓度0.1mg/ml～0.5mg/ml的蛋白酶K、质量体积百分比2％～5％的牛血清白蛋白和10mg/ml～24mg/ml氢氧化钠，余量为水。本专利技术更优选了一种微量核酸释放剂，其中，所述核酸释放剂的各组分配比为：体积百分比0.8％的表面活性剂、质量体积百分比1.75％的氯化钾、质量体积浓度0.5mg/ml的蛋白酶K、质量体积百分比4％的牛血清白蛋白和20mg/ml氢氧化钠，余量为水。本专利技术还提供了一种微量核酸释放剂的制备方法，其中，由以下步骤组成：称取处方量的表面活性剂、氯化钾、蛋白酶K、牛血清白蛋白、氢氧化钠和水后，混合配置溶液，将溶液进行过滤除菌即得所述核酸释放剂。制备方法简单，符合方便临床检测的要求。本专利技术还提供一种微量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微量核酸释放剂，其特征在于，所述核酸释放剂的各组分配比为：体积百分比0.2％～2.5％的Tween‑20、质量体积百分比0.5％～8％的氯化钾、质量体积浓度0.02mg/ml～1.5mg/ml的蛋白酶K、质量体积百分比0.5％～10％的牛血清白蛋白和2mg/ml～50mg/ml氢氧化钠，余量为水。

【技术特征摘要】
1.一种微量核酸释放剂，其特征在于，所述核酸释放剂的各组分配比为：体积百分比0.2％～2.5％的Tween-20、质量体积百分比0.5％～8％的氯化钾、质量体积浓度0.02mg/ml～1.5mg/ml的蛋白酶K、质量体积百分比0.5％～10％的牛血清白蛋白和2mg/ml～50mg/ml氢氧化钠，余量为水。2.根据权利要求1所述的微量核酸释放剂，其特征在于，所述核酸释放剂的各组分配比为：体积百分比0.5％～2％的Tween-20、质量体积百分比1％～5％的氯化钾、质量体积浓度0.05mg/ml～1mg/ml的蛋白酶K、质量体积百分比1％～8％的牛血清白蛋白和5mg/ml～40mg/ml氢氧化钠，余量为水。3.根据权利要求2所述的微量核酸释放剂，其特征在于，所述核酸释放剂的各组分配比为：体积百分比0.5％～1.5％的Tween-20、质量体积百分比1.2％～3％的氯化钾、质量体积浓度0.1mg/ml～0.8mg/ml的蛋白酶K、质量体积百分比2％～6％的牛血清白蛋白和6mg/ml～30mg/ml氢氧化钠，余量为水。4.根据权利要求3所述的微量核酸释放剂，其特征在于，所述核酸释放剂的各组分配比为：体积百分比0.6％～1.0％的Tween-20...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢江峰，
申请(专利权)人：北京一立科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11