微生物发酵生产N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖和/或D‑氨基葡萄糖盐的方法技术

本发明专利技术公开了通过微生物发酵生产N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖和/或D‑氨基葡萄糖盐的方法。该方法主要通过提高微生物中N‑乙酰‑D‑氨基甘露糖激酶的作用，以更高效率和更高产量生产N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖和/或D‑氨基葡萄糖盐。

The method of microbial fermentation of N D acetyl glucosamine and / or D glucosamine salt

The invention discloses a method for the microbial fermentation production of N D acetyl glucosamine and / or D glucosamine salt. The method mainly by improving the microbial N acetyl D epichitosamine kinases, with higher efficiency and higher production yield of N D acetyl glucosamine and / or D glucosamine salt.

【技术实现步骤摘要】
微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖和/或D-氨基葡萄糖盐的方法
本专利技术属于微生物发酵领域。具体地说，本专利技术涉及微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖以及进一步制备D-氨基葡萄糖盐的方法。
技术介绍
N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-Acetyl-D-glucosamine，NAG或GlcNAc)，又称N-乙酰-氨基葡萄糖、N-乙酰葡糖胺，是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，在生物体内具有重要生理功能。N-乙酰-D-氨基葡萄糖在临床上可用于：增强人体免疫系统的功能；抑制恶性肿瘤或纤维细胞的生长；有效治疗各种炎症；作为糖尿病患者低热量甜味剂和婴幼儿食品添加剂等。水解N-乙酰-D-氨基葡萄糖可用于生产D-氨基葡萄糖盐酸盐，后者可作为抗癌、防癌、降血脂、降血压的食品补充剂，是目前壳多糖保健食品系列中第三代保健功能性食品添加剂。此外，N-乙酰-D-氨基葡萄糖在医药行业中是合成抗癌药物氯脲霉素的主要原料；作为生化试剂还可用作抗细菌感染的免疫佐剂和人体抗流感病毒的活化剂。当今世界各地，有大量患者忍受不同程度关节炎痛苦，仅美国就有3300万人忍受骨关节炎及关节疼痛，我国有1.5亿人以上。由于D-氨基葡萄糖产品在关节炎及关节疼痛的治疗与保健方面具有特别功效，因而得到广泛应用，已成为目前国外市场非常重要的原料药品种。N-乙酰-D-氨基葡萄糖据认为具有与D-氨基葡萄糖相似的效果，已知摄取N-乙酰-D-氨基葡萄糖能诱导产生新的软骨，并阻止骨关节炎的发作，或在一些病例中，用来治疗骨关节炎。由于D-氨基葡萄糖有苦味，而N-乙酰-D-氨基葡萄糖有蔗糖50％的甜味，并且很容易被摄取，因此，N-乙酰-D-氨基葡萄糖作为D-氨基葡萄糖的替代物质已引起关注。目前，国内外氨基葡萄糖的来源主要以生物提取为主。生物提取主要是从虾蟹壳中提取甲壳素或壳聚糖，再经浓盐酸水解制备，或用柠檬酸渣经酸碱提取而得。年生产量在2万吨左右。但是，用虾蟹壳提取时，每获得1吨产品将产生大量废渣和100吨以上废水；用柠檬酸渣提取时，每获得1吨产品将产生30-50吨废酸渣，是高污染工艺，在许多地方已禁止使用。而且，来自水产品壳提取的氨基葡萄糖对许多有水产品过敏的患者不适宜，有水产品过敏的人使用后可能会造成严重的过敏问题，甚至危及生命。此外，生物提取纯化工艺复杂，产品有鱼腥味，不稳定。另外，由于环境污染，从虾蟹壳中提取得到的氨基葡萄糖不可避免的受到重金属污染。因此，生物提取方法生产氨基葡萄糖，从数量和质量上都难以满足人们的需求，须开辟新的替代方法。若采用化学合成方法来制备，更存在如下三个缺点：生产成本高；严重的环境污染；有安全性隐患。该方法目前国内外已不采用。相比较而言，微生物发酵法生产氨基葡萄糖是一条良好的途径，微生物发酵法是以葡萄糖和无机盐为原料，选用优良菌种进行液体发酵，并经分离、浓缩、纯化直接生产氨基葡萄糖。生产过程中无有害气体产生。发酵法生产的氨基葡萄糖无鱼腥味，生产不受资源限制。而且利用代谢工程进行菌种改良，产量高，工业化大生产潜力大。因此，微生物发酵法生产氨基葡萄糖在技术工艺上有重大变革，替代传统的生物提取，不仅在成本方面占有优势，在减少三废污染方面也具有一定的环保贡献。微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖常规方法包括：涉及用微生物产生的酶降解来自虾壳原料产生的甲壳素生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法(例如，US5998173，“ProcessforproducingN-acetyl-D-glucosamine”)；用微生物(木霉菌)产生的酶酶解或用酸部分水解纯化来自真菌渣(如柠檬酸发酵使用的黑曲霉菌的菌渣)的甲壳素生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法(例如，US20030073666A1，“N-acetyl-D-glucosamineandprocessforproducingN-acetyl-D-glucosamine”)；用木霉菌直接使用葡萄糖为碳源，不需要来自真菌渣或虾壳产生的甲壳素和壳多糖寡糖为碳源，发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法(例如，US20110059489A1，“MethodforfermentativeproductionofN-acetyl-D-glucosaminebymicroorganism”)；通过培养绿藻病毒(Chlorovirus)感染的小球藻细胞或者导入了源自绿藻病毒的基因的重组大肠杆菌来生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法(例如，JP2004283144A，“MethodforproducingglucosamineandN-acetylglucosamine”)；使用遗传修饰的微生物，特别是遗传修饰的大肠杆菌，发酵生产D-氨基葡萄糖或N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法(例如，US6,372,457，“Processandmaterialsforproductionofglucosamine”；WO2004/003175，“ProcessandmaterialsforproductionofglucosamineandN-acetylglucosamine”)。用微生物或微生物产生的酶来降解源自甲壳类动物如蟹、虾类的壳的甲壳素生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法，较为传统，存在产量低、成本高和动物源不足等问题。通过培养用绿藻病毒感染的小球藻细胞生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法，涉及压碎细胞获取N-乙酰-D-氨基葡萄糖的步骤，存在操作复杂等问题。用木霉菌直接使用葡萄糖为碳源发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法，具有不需要使用来自甲壳类动物壳或真菌渣产生的甲壳素或壳多糖寡糖等碳源的优点，但木霉菌等真菌发酵温度低(27℃)、时间长(10天)、产量偏低(15mg/ml)，从而存在生产周期长、成本高、易污染杂菌等缺点，严重限制了该方法的工业化应用。显然，针对氨基葡萄糖不断增长的市场需求，用遗传修饰的微生物生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖，是实现大规模工业化生产的一条有应用前景的重要方法。而新的遗传修饰的微生物可通过基因重组、基因转移、基因突变、基因删除、基因超表达、代谢途径改变等许多方式获得。美国专利US6,372,457中公开了通过微生物发酵生产D-氨基葡萄糖的方法和材料。该专利技术包括用于该专利技术生产氨基葡萄糖之方法的遗传修饰的微生物，以及重组核酸分子和由所述重组核酸分子产生的蛋白质。该专利技术所述遗传修饰的微生物，主要针对能提高氨基葡萄糖-6-磷酸合酶活性的遗传修饰，包括多种基因突变或氨基酸缺失和取代。但该专利未涉及通过内源性氨基葡萄糖-6-磷酸合酶基因启动子更换或缺失等改变，导致氨基葡萄糖-6-磷酸合酶活性的提高或降低。另外，该专利主要通过氨基葡萄糖-6-磷酸合酶的遗传修饰生产的目的产物仅为D-氨基葡萄糖，未涉及N-乙酰-D-氨基葡萄糖生产。而且，由于D-氨基葡萄糖在发酵液中很不稳定，降解产物可能对微生物有毒性，这种通过遗传修饰生产D-氨基葡萄糖的方式，其产量很低，实际应用存在局限性。WO2004/003175中公开了用于生产D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖的生物合成方法。该方法通过发酵基因修饰微生物以产生氨基葡萄糖和/或N-乙酰-D-氨基葡萄糖。该专利技术还公开了用于生产氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过微生物发酵生产N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖和/或D‑氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：A)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含至少一种能提高微生物中N‑乙酰‑D‑氨基甘露糖激酶作用的遗传修饰；和B)收集从培养步骤A)中产生的N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖。优选，进一步包括C)由N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖脱乙酰化得到D‑氨基葡萄糖盐。进一步优选，所述盐选自盐酸盐、硫酸盐、钠盐、磷酸盐和硫酸氢盐。

【技术特征摘要】
2016.04.05 CN 20161020820391.一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖和/或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：A)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶作用的遗传修饰；和B)收集从培养步骤A)中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖。优选，进一步包括C)由N-乙酰-D-氨基葡萄糖脱乙酰化得到D-氨基葡萄糖盐。进一步优选，所述盐选自盐酸盐、硫酸盐、钠盐、磷酸盐和硫酸氢盐。2.如权利要求1所述的方法，其中，提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶作用的遗传修饰选自a)微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的酶活性增加；和/或b)微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。3.如权利要求2所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的核酸序列含有至少一种增加N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的酶活性的遗传修饰；进一步优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQIDNO：17的下述位置处的取代中的一种或多种：第36位赖氨酸被精氨酸取代、第103位异亮氨酸被蛋氨酸取代和第223位精氨酸被丝氨酸取代；更优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的核酸序列为SEQIDNO：26。优选，所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶具有与SEQIDNO:17的氨基酸序列至少约30％相同，优选至少约50％相同，进一步优选至少约70％相同，进一步优选至少约80％相同，更进一步优选至少约90％相同，最优选至少约95％相同的氨基酸序列，其中所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶具有酶活性；进一步优选，所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶具有SEQIDNO:17的氨基酸序列。进一步优选，重组核酸分子中编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子；优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。4.如权利要求2所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰；优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换；进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：(1)包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶作用的遗传修饰；(2)包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰，优选同时包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰；(3)包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰，并同时包含至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰；(4)包含至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)作用的遗传修饰。6.如权利要求5所述的方法，其中，提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶作用的遗传修饰选自a)微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的酶活性增加；和/或b)微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。7.如权利要求6所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的核酸序列含有至少一种增加N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的酶活性的遗传修饰。优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQIDNO：29的下述位置处的取代中的一种或两种：第133位半胱氨酸被精氨酸取代和第187位酪氨酸被组氨酸取代。进一步优选，编码所述N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)的核酸序列为SEQIDNO：56。优选，所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶具有与SEQIDNO：29的氨基酸序列至少约30％相同，优选至少约50％相同，进一步优选至少约70％相同，进一步优选至少约80％相同，更进一步优选至少约90％相同，最优选至少约95％相同的氨基酸序列，其中所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶具有酶活性；进一步优选，所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶具有SEQIDNO：29的氨基酸序列。进一步优选，重组核酸分子中编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子；优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。8.如权利要求6所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰；优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换；进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。9.如权利要求5所述的方法，其中，提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰选自a)微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的酶活性增加；和/或b)微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。10.如权利要求9所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的核酸序列含有至少一种增加D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的酶活性的遗传修饰。进一步优选，重组核酸分子中编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子；优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。11.如权利要求9所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换；进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。12.如权利要求5所述的方法，其中，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰选自a)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性降低；和/或b)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的表达减少；优选，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。进一步优选，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰选自编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活；更优选，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰为编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因的内源性天然启动子完全缺失，即被删除。13.如权利要求5所述的方法，其中，提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰选自a)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性增加；和/或b)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。14.如权利要求13所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的核酸序列含有至少一种增加氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性的遗传修饰。进一步优选，重组核酸分子中编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子；优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。15.如权利要求13所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换；进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。16.如权利要求5所述的方法，其中，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰选自a)微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的酶活性降低；和/或b)微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的表达减少；优选，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。进一步优选，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰选自编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活；更优选，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰为编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶基因的内源性天然启动子完全缺失，即被删除。17.如权利要求5所述的方法，其中，提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶作用的遗传修饰选自a)微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的酶活性增加；和/或b)微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。18.如权利要求17所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的核酸序列含有至少一种增加UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的酶活性的遗传修饰。优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQIDNO：50的下述位置处的取代中的一种或多种：第34位半胱氨酸被丝氨酸取代、第145位组氨酸被天冬氨酸取代、第226位半胱氨酸被苯丙氨酸取代和245位缬氨酸被甘氨酸取代；更优选，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)的核酸序列为SEQIDNO：58。优选，所述的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶具有与SEQIDNO：50的氨基酸序列至少约30％相同，优选至少约50％相同，进一步优选至少约70％相同，进一步优选至少约80％相同，更进一步优选至少约90％相同，最优选至少约95％相同的氨基酸序列，其中所述的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)具有酶活性；进一步优选，所述的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶具有SEQIDNO：50的氨基酸序列。进一步优选，重组核酸分子中编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子；优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。19.如权利要求17所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰；优选，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换；进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。20.如权利要求1-19任一项所述的方法，其中，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：(1)包含至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(ManXYZ)作用的遗传修饰；(2)包含至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶(NanA)作用的遗传修饰；(3)包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)作用的遗传修饰；(4)包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(NagE)作用的遗传修饰；(5)包含至少一种能提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)作用的遗传修饰；(6)包含至少一种能提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)作用的遗传修饰。21.如权利要求20所述的方法，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(ManXYZ)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。优选，降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(ManXYZ)作用的遗传修饰选自编码微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(ManXYZ)的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(ManXYZ)基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活；更优选，降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(ManXYZ)作用的遗传修饰为编码微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(ManXYZ)的内源性基因完全缺失，即被删除。22.如权利要求20所述的方法，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶(NanA)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。优选，降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶(NanA)作用的遗传修饰选自编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶(NanA)的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶(NanA)基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活；更优选，降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶(NanA)作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶(NanA)的内源性基因完全缺失，即被删除。23.如权利要求20所述的方法，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。优选，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)作用的遗传修饰选自编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活；更优选，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)的内源性基因完全缺失，即被删除。24.如权利要求20所述的方法，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(NagE)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。优选，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(NagE)作用的遗传修饰选自编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(NagE)的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(NagE)基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活；更优选，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(NagE)作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(NagE)的内源性基因完全缺失，即被删除。25.如权利要求20所述的方法，其中，提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)作用的遗传修饰选自a)微生物中磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)的酶活性增加；和/或b)微生物中磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。26.如权利要求25所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)的核酸序列含有至少一种增加磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)的酶活性的遗传修饰。进一步优选，重组核酸分子中编码磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子；优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。27.如权利要求25所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)的基因的内源性天然启动子的遗传修饰；优选，编码磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换；进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。28.如权利要求20所述的方法，其中，提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)作用的遗传修饰选自a)微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)的酶活性增加；和/或b)微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。29.如权利要求28所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)的核酸序列含有至少一种增加双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)的酶活性的遗传修饰。进一步优选，重组核酸分子中编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子；优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。30.如权利要求28所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)的基因的内源性天然启动子的遗传修饰；优选，编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换；进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中，重组核酸分子被装入质粒中或重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中，所述重组核酸分子的表达是可诱导的；优选，所述重组核酸分子的表达可由乳糖诱导。33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中，所述培养步骤A)在约20℃-约45℃进行；优选，在约33℃-约37℃进行。优选，所述培养步骤A)在约pH4.5-约pH8.5进行；优选在约pH6.7-约pH7.2进行。优选，所述培养步骤A)采用补料发酵法。进一步优选，补糖液包含葡萄糖和核糖，优选，葡萄糖浓度为10％-85％(w/v)，核糖浓度为0.5％-15％(w/v)，进一步优选，葡萄糖浓度为55％-75％(w/v)，核糖浓度为5％-7％(w/v)；进一步优选，补糖液包含葡萄糖和葡萄糖酸盐，优选，葡萄糖浓度为10％-85％(w/v)，葡萄糖酸盐浓度为0.5％-15％(w/v)，进一步优选，葡萄糖浓度为55％-75％(w/v)，葡萄糖酸盐浓度为2％-3％(w/v)；进一步优选，补糖液包含葡萄糖、核糖和葡糖酸盐，优选，葡萄糖浓度为10％-85％(w/v)，核糖浓度为0.5％-15％(w/v)，葡萄糖酸盐浓度为0.5％-15％(w/v)，进一步优选，葡萄糖浓度为55％-75％(w/v)，核糖浓度为5％-7％(w/v)，葡萄糖酸盐浓度为2％-3％(w/v)。更优选，葡萄糖酸盐为葡萄糖酸钠。34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中，所述收集步骤B)包括(a)从去除微生物的发酵液中沉淀N-乙酰-D-氨基葡萄糖；和/或(b)从去除微生物的发酵液中结晶N-乙酰-D-氨基葡萄糖。优选，所述收集步骤B)进一步包括将发酵液脱色的步骤；进一步优选，所述脱色步骤在对发酵液进行沉淀或结晶之前、在对发酵液进行一次或多次沉淀或结晶重溶解之后进行；更优选，所述脱色步骤包括活性炭处理和/或色谱脱色。35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中，所述步骤C)在酸性和加热条件下进行或在酶催化下进行。优选，在30％-37％盐酸溶液中、60℃-90℃下脱乙酰化水解N-乙酰-D-氨基葡萄糖得到D-氨基葡萄糖盐酸盐。优选，在UDP-3-O-N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶作用下水解N-乙酰-D-氨基葡萄糖得到D-氨基葡萄糖，并进一步成盐。36.一种微生物，该微生物包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶作用的遗传修饰。37.如权利要求36所述的微生物，其中，提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶作用的遗传修饰选自a)微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的酶活性增加；和/或b)微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶被过量表达；优选，微生...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙镧，
申请(专利权)人：孙镧，
类型：发明
国别省市：江苏,32