一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法技术

本发明专利技术属于疫苗技术领域，具体涉及一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法。所述方法包括：制备猪伪狂犬病(XF‑1株)病毒液；采用连续流离心、中空纤维柱澄清过滤、中空纤维柱超滤浓缩、及Sepharose 4FF分子筛凝胶层析纯化处理后得到纯化猪伪狂犬病毒；再向纯化的猪伪狂犬病毒中加入终浓度为0.4％(v/v)的甲醛溶液，于37℃条件下灭活48h，然后与201佐剂乳化制备得到猪伪狂犬病灭活疫苗。本发明专利技术所述的猪伪狂犬病灭活疫苗对市场所流行的高致病性变异伪狂犬病能起到很好的保护效果。

A method for large-scale production of inactivated Pseudorabies Vaccine against swine

The invention belongs to the field of vaccine technology, and specifically relates to a method for large-scale production of inactivated Pseudorabies Vaccine for pigs. The method comprises the following steps: preparation of porcine pseudorabies virus (XF strain 1) liquid; by continuous centrifugation, hollow fiber, hollow fiber column column filtration and ultrafiltration, Sepharose gel chromatography purification 4FF molecular sieve was obtained after purification of porcine pseudorabies virus; to purified porcine pseudorabies virus is added in the end the concentration of 0.4% (v/v) of Formaldehyde Solution, in the temperature of 37 DEG C and 201 48h inactivated, then adjuvant emulsion was prepared by porcine pseudorabies inactivated vaccine. The inactivated Pseudorabies Vaccine of the invention has a good protection effect on the highly pathogenic variant pseudorabies in the market.

【技术实现步骤摘要】
一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法
本专利技术属于疫苗
，具体涉及一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法。
技术介绍
伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪该是本病的天然宿主和贮存者，该病以发热、奇痒、脑脊髓炎和严重的繁殖障碍为主要特征。从2011年以来，全国多省份使用gE基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场，母猪出现产弱仔猪、死胎、木乃伊、流产；后备母猪和空怀母猪常出现返情、屡配不孕或不发情的情况；公猪感染后常出现睾丸萎缩，性功能下降失去种用能力；新仔猪出现神经症状及死亡等疑似伪狂犬病的临床症状；育肥猪表现为呼吸道症状和增重滞缓，给养猪业造成较大的经济损失。因此，更多怀疑当前伪狂犬流行毒株是否发生变异，从而导致疫苗保护失效。这种猜测随后也被得到证实。华中农大、中国农大、南京农大、中国动物疫病控制中心等通过多项实验研究表明，新发生伪狂犬病是由新的毒株引起的。华中农业大学动物疫病诊断中心将全国各省份发病猪病料中分离的伪狂犬野毒进行基因测序，结果表明，当前分离的流行毒株在TK、gB、gE、gC等基因发生了多个碱基的标志性突变和连续性缺失，这些突变和缺失有可能是导致当前猪伪狂犬再次流行的一个重要原因。目前商品化疫苗免疫产生的抗体对目前流行毒株的中和能力较差。变异毒株的出现使得成年猪也表现出与仔猪相似的严重症状，猪场母猪、仔猪、育肥猪大量死亡，给该病的防控提出新的难题，同时对当今的养猪业也造成严重的经济损失。预防该疾病最行之有效的办法是接种疫苗。目前，市售的猪伪狂犬病疫苗绝大多数为猪伪狂犬病常规灭活疫苗和弱毒疫苗。但由于流行毒株不断发生变异，与市售疫苗在免疫原性方面存在差异，导致传统毒株制备的疫苗不能很好的防控当今流行的猪伪狂犬病。因此，需要研究开发针对目前变异伪狂犬病毒的疫苗，是解决目前流行猪伪狂犬病的最佳途径。目前商品化猪伪狂犬病病毒疫苗主要采用转瓶培养工艺，如将伪狂犬病病毒接入已经贴壁的传代细胞或原代细胞，培养一段时间后收获病毒液。如专利申请CN101695573A。在悬浮培养方面，有利用微载体进行生物反应器培养伪狂犬病病毒的报道。如专利申请CN101695572A和CN102038946A。但是上述方法，工艺复杂，污染风险大或均需借助价格昂贵的微载体才能进行细胞悬浮培养，生产成本相对较高；借助微载体培养时，需使用胰酶消化，消化后细胞利用率低，生产工艺复杂，不利于较大规模培养。也有公开报道纯悬浮培养猪伪狂犬病毒，如专利CN105727277A。我国在3000L以上大规模培养方面，由于悬浮工艺技术难度大还停留在理论上。加上国外对大规模培养工艺技术垄断或禁止出口相关技术，这为我国在大规模培养工艺技术方面增加难度系数。因此研制一种工艺简单稳定、超大规模培养、并能制备高含量猪伪狂犬病病毒的生产方法具有十分重要的意义。另外，我国常规生产纯化工艺主要通过抗原离心，死端过滤，膜包浓缩等方式生产猪伪狂犬病毒灭活疫苗。常规工艺生产的猪伪狂犬病灭活疫苗，在临床应用中有一定的副反应，主要原因就是病毒抗原中除有效抗原外还有其他成分。这些成分包括：病毒培养用动物细胞的残留蛋白质和残留DNA；培养基残留如小牛血清；灭活剂残留等。这些异源成分不仅会引起免疫动物的副反应，而且会大大降低疫苗的免疫效果。以灭活病毒作为抗原的纯化工艺主要以自然沉降、连续流离心、中空纤维澄清、膜包浓缩工艺为主。传统的转瓶培养抗原结合常规的生产工艺，生产的猪伪狂犬病毒灭活疫苗中有效抗原含量增加，同时有害物质残留量浓度也升高，从而导致疫苗产品存在副反应大，免疫效果不佳等不利影响。因此，对灭活疫苗而言，提高抗原纯度，对制品的安全性、免疫效果都有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，目的在于提供一种适用于3000L生物反应器大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法，包括如下步骤：(1)猪伪狂犬病病毒XF-1株的制备：利用生物反应器培养BHK-21细胞悬液，然后接种猪伪狂犬病病毒，培养一段时间后，收获猪伪狂犬病病毒液；(2)猪伪狂犬病病毒的纯化：将猪伪狂犬病病毒液连续流离心，吸取上清并利用中空纤维柱澄清过滤；再利用中空纤维柱超滤浓缩；最后利用分子筛凝胶层析柱对病毒浓缩液进行纯化，收集第一个洗脱峰对应的洗脱液，即为高纯度的猪伪狂犬病毒液；(3)将高纯度的猪伪狂犬病毒灭活，经检验合格后，再与疫苗佐剂乳化制备得到猪伪狂犬病灭活疫苗。上述方案中，所述猪伪狂犬病病毒株为XF-1株，该毒株已于2016年10月19日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:V201654，该菌株已经在专利技术专利中公开(专利技术专利的名称：一种猪伪狂犬病病毒变异株XF-1株及制备方法和应用，申请号：201610979825.1，公开号：106497890A)。上述方案中，步骤(1)所述猪伪狂犬病病毒的制备，利用生物反应器培养BHK-21细胞悬液，当细胞密度为2.0×106～5.0×106个/mL，细胞活力≥93％时，接种猪伪狂犬病毒XF-1株，接种剂量为3‰～8‰(v/v)；当BHK-21细胞密度低于1.0×106个/mL或细胞活力≤20％时，收获猪伪狂犬病病毒液。上述方案中，步骤(2)所述用于澄清过滤的中空纤维柱的孔径为0.45μm～0.65μm；所述用于超滤浓缩的中空纤维柱的孔径为500KD～750KD；所述分子筛凝胶层析柱的填料为Sepharose4FF琼脂糖凝胶层析填料。上述方案中，步骤(2)中所述中空纤维柱澄清过滤时采用的跨膜压为2～3psi，进液端流速为60～80L/min；所述中空纤维柱超滤浓缩的时采用的跨膜压为10～15psi，循环流速为30～50L/min；所述利用分子筛凝胶层析柱层析时，病毒浓缩液上样的线性流速为45～100cm/h，压力小于2.5bar，上样量控制在10％～15％柱体积，洗脱采用的洗脱剂为0.01mol/LPBS溶液。上述方案中，步骤(2)所述利用中空纤维柱澄清过滤的具体操作为：首先用无菌的0.5mol/LNaOH溶液对中空纤维柱进行循环灭菌处理，再用无菌注射水对中空纤维柱进行清洗，直至pH为6.8～7.2，然后用无菌0.01mol/LPBS溶液平衡中空纤维柱，最后将猪伪狂犬病毒待澄清液通过中空纤维柱澄清过滤，收集透过端液体，得到病毒澄清液。所述猪伪狂犬病毒待澄清液通过中空纤维柱澄清过滤的过程为：先透过60％～70％待澄清上清液，然后补加与剩余待澄清上清液等体积的0.01mol/LPBS溶液，继续透过，待透过液体的体积等于加入的PBS溶液体积后，再补加与剩余待澄清上清液等体积的0.01mol/LPBS溶液，如此洗滤多次后，至残渣不能透过，收集透过端液体，得到病毒澄清液。上述方案中，步骤(2)所述中空纤维柱超滤浓缩的过程为：首先用无菌的0.5mol/LNaOH溶液对中空纤维柱进行循环灭菌处理，再用无菌注射水对中空纤维柱进行清洗，直至pH为6.8～7.2，然后用无菌0.01mol/LPBS溶液平衡中空纤维柱，最后将病毒澄清液通过中空纤维柱超滤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）猪伪狂犬病病毒的制备：利用生物反应器培养BHK‑21 细胞悬液，然后接种猪伪狂犬病病毒，培养一段时间后，收获猪伪狂犬病病毒液；（2）猪伪狂犬病病毒的纯化：将猪伪狂犬病病毒液连续流离心，取上清并利用中空纤维柱澄清过滤后；再利用中空纤维柱对病毒进行超滤浓缩；最后利用分子筛凝胶层析柱对病毒进行纯化，收集第一个洗脱峰对应的洗脱液，即为高纯度猪伪狂犬病毒液；（3）将步骤（2）所得高纯度的猪伪狂犬病毒液灭活，经检验合格后，再与疫苗佐剂乳化制备得到猪伪狂犬病灭活疫苗。

【技术特征摘要】
1.一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）猪伪狂犬病病毒的制备：利用生物反应器培养BHK-21细胞悬液，然后接种猪伪狂犬病病毒，培养一段时间后，收获猪伪狂犬病病毒液；（2）猪伪狂犬病病毒的纯化：将猪伪狂犬病病毒液连续流离心，取上清并利用中空纤维柱澄清过滤后；再利用中空纤维柱对病毒进行超滤浓缩；最后利用分子筛凝胶层析柱对病毒进行纯化，收集第一个洗脱峰对应的洗脱液，即为高纯度猪伪狂犬病毒液；（3）将步骤（2）所得高纯度的猪伪狂犬病毒液灭活，经检验合格后，再与疫苗佐剂乳化制备得到猪伪狂犬病灭活疫苗。2.根据权利要求1所述的大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法，其特征在于，所述猪伪狂犬病病毒株为XF-1株，该毒株已于2016年10月19日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO：V201654。3.根据权利要求1所述的大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤（1）所述猪伪狂犬病病毒液的制备，利用生物反应器培养BHK-21细胞悬液，当细胞密度为2.0×106～5.0×106个/mL，细胞活力≥93%时，接种猪伪狂犬病毒XF-1株；当BHK-21细胞密度低于1.0×106/mL或细胞活力≤20%时，收获猪伪狂犬病病毒液。4.根据权利要求1所述的大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤（2）所述用于澄清过滤中空纤维柱的孔径为0.45μm~0.65μm，所述用于超滤浓缩中空纤维柱的孔径为500KD~750KD，所述分子筛凝胶层析柱的填料为Sepharose4FF琼脂糖凝胶层析填料。5.根据权利要求1所述的大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤（2）中所述中空纤维柱澄清过滤时采用的跨膜压为2.0~3.0psi，进液端流速为60~80L/min；所述中空纤维柱超滤浓缩的时采用的跨膜压为10~15psi，循环流速为30L/min~50L/min；所述利用分子筛凝胶层析柱层析时，病毒浓缩液上样的线性流速为45~100cm/h，压力小于2.5bar，上样量控制在10%~15%柱体积，洗脱采用的洗脱剂为0.01mol/LPBS。6.根据权利要求1所述的大规模生产...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐高原，陈波，周明光，洪灯，方玉林，陈关平，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42