三维肺微组织模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种三维肺微组织模型的构建方法，包括以下步骤：使用荧光蛋白分别标记LC‑3的肺巨噬细胞与肺上皮细胞，然后共混于聚阴离子聚电解质的水溶液中，得到细胞共混液；利用静电液滴法将细胞共混液滴入含二价金属离子的凝胶浴中，形成载细胞凝胶微球；将载细胞凝胶微球培养14‑28天，得到三维肺微组织模型。本发明专利技术还提供了采用上述方法所构建的三维肺微组织模型作为体外检测和评价肺自噬效应模型的应用。本发明专利技术在体外构建了三维肺微组织模型，比二维模型更接近体内情况；所构建的三维模型，可直观检测外界物质引发的自噬效应情况。

Construction method and application of three-dimensional lung micro tissue model

The invention relates to a construction method of 3D lung micro organization model, which comprises the following steps: using fluorescent proteins were labeled with LC 3 lung macrophages and lung epithelial cells, and then blend in aqueous solution of poly anionic polyelectrolyte in the cell mixture; using electrostatic droplet method will blend the droplets into the cell bath gel containing two valence metal ions, formation of cell carrying gel microspheres; the cell carrying Gel Microspheres incubated for 14 28 days, three lung micro organization model. The present invention also provides the application of the three-dimensional lung tissue model constructed by the above method as a model for detecting and evaluating the lung autophagy effect in vitro. The three-dimensional lung tissue model is constructed in vitro, which is closer to the body than the two-dimensional model; the three-dimensional model constructed can visually detect the autophagy effect caused by the external substances.

【技术实现步骤摘要】
三维肺微组织模型的构建方法及应用
本专利技术涉及生物医学领域，尤其涉及一种三维肺微组织模型的构建方法及应用。
技术介绍
自噬与细胞凋亡、细胞衰老一样，是十分重要的生物学现象，参与生物的发育、生长等多种过程。细胞自噬的异常会导致癌细胞的出现。而一些外源物质，如纳米粒、环境污染物、药物等会引发人体内不同程度的细胞自噬。目前对外源物质引发细胞自噬的检测均是基于二维单一细胞的检测，但是体外二维细胞由于细胞极化，缺乏细胞-细胞和细胞基质间的相互作用，其评价结果往往不能外推关联到体内，在组织层面上仍无法实现细胞自噬的体外研究。因此亟需寻找一个体外类组织模型，在三维状态下，快速有效观察待测物引发的自噬效应。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种三维肺微组织模型的构建方法及应用，采用本专利技术的方法所构建的三维模型，可直观检测外界物质引发的自噬效应情况。本专利技术提供了一种三维肺微组织模型的构建方法，包括以下步骤：(1)使用荧光蛋白分别标记LC-3的肺巨噬细胞与肺上皮细胞，然后均匀共混于聚阴离子聚电解质的水溶液中，得到细胞共混液；(2)利用静电液滴法将步骤(1)得到的细胞共混液滴入含二价金属离子的凝胶浴中，形成载细胞凝胶微球；(3)将步骤(2)得到的载细胞凝胶微球培养14-28天，得到三维肺微组织模型。进一步地，在步骤(1)中，LC-3的肺巨噬细胞与肺上皮细胞在荧光蛋白标记后，肺巨噬细胞与肺上皮细胞为不同颜色。用两种颜色可区分肺巨噬细胞和肺上皮细胞。LC-3为自噬相关标志物。进一步地，在步骤(1)中，使用绿色荧光蛋白标记LC-3的肺巨噬细胞，使用红色荧光蛋白标记LC-3的肺上皮细胞。进一步地，绿色荧光蛋白为GFP、EGFP或sfGFP蛋白；红色荧光蛋白为RFP、mRFP或mcherry蛋白。进一步地，在步骤(1)中，肺巨噬细胞为THP-1、RAW264.7或U937细胞，肺上皮细胞为BEAS-2B、A549、NCI-H441或TC-1细胞。进一步地，在步骤(1)中，肺巨噬细胞与肺上皮细胞的个数比为1:2-2:1。进一步地，在步骤(1)中，细胞共混液中的细胞密度为2×105-1×107cells/mL。进一步地，在步骤(1)中，聚阴离子聚电解质为海藻酸钠、透明质酸、琼脂、明胶和果胶中的一种或几种。进一步地，在步骤(1)中，聚阴离子聚电解质的水溶液的浓度为1％w/v-1.5％w/v。进一步地，在步骤(2)中，含二价金属离子的凝胶浴为含二价金属离子的氯化钠溶液，金属离子为钙离子、钡离子、镁离子和铁离子中的一种或几种。在步骤(2)中，细胞共混液滴入凝胶浴后，二价金属离子能够螯合聚电解质中的阴离子，整个反应体系从溶液态转变为凝胶态，因而形成了载细胞凝胶微球，使用该方法，所形成的载细胞凝胶微球大小均一、粒径均匀、球形度高、形貌控制好。在步骤(3)中，三维肺微组织模型为荧光蛋白标记的肺巨噬细胞与肺上皮细胞的三维细胞聚集体结构。本专利技术还提供了一种采用上述方法所构建的三维肺微组织模型作为体外检测和评价肺自噬效应模型的应用。进一步地，三维肺微组织模型的构建方法，包括以下步骤：(1)使用荧光蛋白分别标记LC-3的肺巨噬细胞与肺上皮细胞，然后均匀共混于聚阴离子聚电解质的水溶液中，得到细胞共混液；(2)利用静电液滴法将步骤(1)得到的细胞共混液滴入含二价金属离子的凝胶浴中，形成载细胞凝胶微球；(3)将步骤(2)得到的载细胞凝胶微球培养14-28天，得到三维肺微组织模型。进一步地，应用时将待测物加入三维肺微组织模型中，定性或定量检测LC-3II在肺巨噬细胞与肺上皮细胞中的表达，以判定待测物引发的肺自噬效应类型。进一步地，上述待测物为各种人体外源物质，如具有不同化学组成和理化性质的纳米粒、药物、环境污染物等。进一步地，由于分别使用不同颜色的荧光标记了标记肺巨噬细胞与肺上皮细胞，因此在激光共聚焦显微镜下可观察到不同颜色荧光斑的分布和数目，对其进行定性或定量分析，判断待测物引发的是肺上皮细胞还是肺巨噬细胞的自噬流异常，并以此判定待测物引发的肺自噬效应类型。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：1、本专利技术采用较简单的方法在体外构建多细胞共培养的三维肺微组织模型，其性质比二维模型更接近体内。2、本专利技术构建的三维微组织模型中，使用不同荧光标记LC-3的肺细胞，可直观检测待测物的自噬效应，以及各种肺细胞中的分布情况。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。附图说明图1是本专利技术载细胞凝胶微球的光镜照片；图2图示了实施例2中外源物质引发的三维肺微组织模型的自噬异常情况；图3是本专利技术涉及纳米粒引发细胞自噬异常的原理图。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1配置浓度为1.5％w/v的无菌海藻酸钠水溶液，将绿色荧光蛋白标记LC-3的肺巨噬细胞THP-1和红色荧光蛋白标记LC-3肺上皮细胞A549离心后，以1:1的细胞比例均匀共混于海藻酸钠水溶液中，得到细胞共混液，其中细胞密度为2×106cells/mL。利用静电液滴法将细胞共混液滴入含Ca2+的凝胶浴中(凝胶浴为氯化钠的水溶液)，形成大小均一、粒径均匀的载细胞凝胶微球。静电液滴法的具体操作步骤参见文献“Investigationofsphericalhydrogelsurfacewithopticalinterferometer,ColloidsandSurfacesA:PhysicochemicalandEngineeringAspects,484(2015)：457-462”中的方法。对载细胞微球进行表征，测试结果如图1所示，从图中可以看出，本专利技术的载细胞凝胶微球的粒径均一，且细胞均匀分布在凝胶颗粒中。随后在10％血清的DMEM培养基中，将载细胞微球进行共培养，培养时间为28天，载细胞微球内的两种细胞形成三维细胞聚集体结构，即三维肺微组织模型。将25μg/mL氯喹加入三维肺微组织模型中，在激光共聚焦显微镜下观察红色荧光斑和绿色荧光斑的分布和数目。然后定性和定量分析红色荧光斑和绿色荧光斑，判断氯喹引发三维肺微组织中THP-1和A549细胞的自噬流异常情况。结果表明，使用氯喹处理三维肺微组织模型后，可引发较强的红色荧光斑和绿色荧光斑，因此在氯喹作用下，肺上皮细胞A549和肺巨噬细胞THP-1均会产生强烈的自噬异常。实施例2配置浓度为1.5％w/v的无菌海藻酸钠水溶液，将绿色荧光蛋白标记LC-3的THP-1和红色荧光蛋白标记LC-3的BEAS-2B离心后，以1:1的细胞比例均匀共混于海藻酸钠水溶液中，得到细胞共混液，其中细胞密度为2×106cells/mL。利用静电液滴法将细胞共混液滴入含Ca2+的凝胶浴中(凝胶浴为氯化钠的水溶液)，形成大小均一、粒径均匀的载细胞凝胶微球。具体操作步骤与实施例1相同。参照实施例1的方法，将载细胞微球进行共培养，培养时间为28天，载细胞微球内的两种细胞形成三维细胞聚集体结构，即三维肺微组织模型。将50μg/mLLa2O3纳米粒加入三维肺微组织模型中，在激光共聚焦显微镜下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种三维肺微组织模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使用荧光蛋白分别标记LC‑3的肺巨噬细胞与肺上皮细胞，然后共混于聚阴离子聚电解质的水溶液中，得到细胞共混液；(2)利用静电液滴法将步骤(1)得到的所述细胞共混液滴入含二价金属离子的凝胶浴中，形成载细胞凝胶微球；(3)将步骤(2)得到的所述载细胞凝胶微球培养14‑28天，得到所述三维肺微组织模型。

【技术特征摘要】
1.一种三维肺微组织模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使用荧光蛋白分别标记LC-3的肺巨噬细胞与肺上皮细胞，然后共混于聚阴离子聚电解质的水溶液中，得到细胞共混液；(2)利用静电液滴法将步骤(1)得到的所述细胞共混液滴入含二价金属离子的凝胶浴中，形成载细胞凝胶微球；(3)将步骤(2)得到的所述载细胞凝胶微球培养14-28天，得到所述三维肺微组织模型。2.根据权利要求1所述的三维肺微组织模型的构建方法，其特征在于：在步骤(1)中，LC-3的肺巨噬细胞与肺上皮细胞在荧光蛋白标记后，二者为不同颜色。3.根据权利要求1所述的三维肺微组织模型的构建方法，其特征在于：在步骤(1)中，肺巨噬细胞为THP-1、RAW264.7或U937细胞，肺上皮细胞为BEAS-2B、A549、NCI-H441或TC-1细胞。4.根据权利要求1所述的三维肺微组织模型的构建方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述肺巨噬细胞与肺上皮细胞的个数比为1:2-2:1。5.根据权利要求1所述的三维肺微组织模型的构...

【专利技术属性】
技术研发人员：李瑞宾，郑会珍，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32