一种海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定方法，从海洋生物体的组织样品中分离出含半胱亚磺酸脱羧酶的溶液，在合适的反应条件下将加入的磺基丙氨酸转化成牛磺酸，加入合适的衍生化试剂测定生成的牛磺酸的含量，进而计算半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力，所述衍生化试剂经向甲醇中溶解邻苯二甲醛，再加入乙硫醇混合，然后用硼酸钠缓冲液定容得到，可以准确、简洁、安全的测定海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力，而且检测成本低，同时也可以用于其他动物体内的半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定，具有普遍适用性。

A method for determining the activity of cysteine decarboxylase decarboxylase in marine organisms

The invention belongs to the technical field of biological detection method for determination of enzyme activity, in particular to a marine organism CSAD the isolated solution containing cysteine sulfinate decarboxylase from marine organism tissue samples, cysteic acid under appropriate reaction conditions will be added into taurine was added to generate the derivatization reagent suitable for determination of taurine, enzyme activity and calculation of cysteine sulfinate decarboxylase, the derivatization reagent was dissolved in methanol to the adjacent benzene two formaldehyde, adding ethyl mercaptan mixture, then using sodium borate buffer sizing, can be accurate and concise and safe determination of marine organisms in half cysteine sulfinate decarboxylase enzyme activity, and low detection cost, but also can be used for determination of enzyme activity in vivo animal CSAD of, It has universal applicability.

【技术实现步骤摘要】
一种海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定方法。
技术介绍
半胱亚磺酸脱羧酶是一种氨基酸脱羧酶，用于催化半胱亚磺酸脱羧产生氨乙基亚磺酸和二氧化碳的酶，胺乙基亚磺酸经过脱氢而生成牛磺酸。该酶可在动物的肝脏、脾脏、肾脏、小肠壁等中见到，以磷酸吡哆醛为辅酶。而牛磺酸是一种含硫的非蛋白氨基酸，在动物体内以游离状态存在，是调节机体正常生理活动的活性物质，具有广泛的生理功能，可以增强细胞抗氧化能力、保护心肌细胞、提高神经传导和视觉机能、防止心血管病、改善内分泌状态，在临床上被广泛应用于心血管疾病、糖尿病、消化道疾病、神经系统疾病、眼部疾病等一系列疾病的治疗，在哺乳动物的主要脏器，以及海洋生物，特别是海鱼、贝类中广泛分布。但是动物体内牛磺酸的生物合成途径较为复杂，尤其是相比于哺乳动物，海洋生物体内牛磺酸含量虽然非常丰富，但其合成途径的机理还不清楚。因此以生产牛磺酸主要途径中的半胱亚磺酸脱羧酶为对象，通过建立快速灵敏的分析方法来评价不同种类海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的活力，对于后续进一步研究海洋生物体内牛磺酸的合成途径具有重要作用，但目前尚未有对半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的研究，也未有建立针对半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的准确、简捷、安全的测定方法。中国专利CN201410369496X，专利名称一种鱼类组织中三种脱碘酶活性的测定方法，申请日期2014年7月31日，公开了一种利用碘125标记分别与三种脱碘酶相适应的三种底物，经过一段时间孵育后测定脱碘酶脱下的碘离子的放射性强度，经公式计算出脱碘酶的酶活性的方法，以测定三种类型的脱碘酶ID1、ID2、ID3。但是该方法具有特定的适用性，适用于脱碘酶的活力测定，而且测定碘离子的放射性强度对仪器的要求高，因此不适合半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定。
技术实现思路
针对半胱亚磺酸脱羧酶对弄清牛磺酸的合成机理具有重要意义，但目前尚未有对半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的研究问题，本专利技术的目的在于提供一种海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定方法，可以准确、简洁、安全的测定海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力，而且检测成本低，同时也可以用于其他动物体内的半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定，具有普遍适用性。本专利技术提供如下的技术方案：一种海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定方法，从海洋生物体的组织样品中分离出含半胱亚磺酸脱羧酶的溶液，在合适的反应条件下将加入的磺基丙氨酸转化成牛磺酸，测定生成的牛磺酸的含量，进而计算半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力。本专利技术的海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定方法中，首先对海洋生物体的组织样品进行处理，分离出含半胱亚磺酸脱羧酶的溶液，然后以磺基丙氨酸为底物，向含半胱亚磺酸脱羧酶的溶液中定量加入磺基丙氨酸，并经半胱亚磺酸脱羧酶和进一步的脱氢反应转化成牛磺酸，通过测定生成的牛磺酸的含量计算出半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力，其中酶活力单位U定义为每分钟催化生成1μg的牛磺酸所需的酶量，这样酶活力的计算公式为：EA＝M/T，其中EA指酶活力U，M指牛磺酸的质量μg，T指反应时间min。这样通过转化与半胱亚磺酸脱羧酶相适应的磺基丙氨酸底物，准确、定量的计算出半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力，而且不仅适用于海洋生物，也适用于一般的动物体。作为本专利技术放过的一种改进，测定生成的牛磺酸的含量包括以下步骤，首先向含牛磺酸的溶液中加入合适的衍生化试剂，然后经高效液相色谱法测定衍生物的浓度。通过衍生化试剂将牛磺酸转化成衍生物，提高检测的准确性。作为本专利技术方法的一种改进，所述衍生化试剂经以下过程制备而成：向1mL的甲醇中溶解0.01g的邻苯二甲醛，再加入0.01mL的乙硫醇混合，然后用0.4mol/L的硼酸钠缓冲液定容至10mL得到衍生化试剂。常用的衍生试剂包括异硫氰酸苯酯、单磺酰氯试剂，但是异硫氰酸苯酯毒性高，对色谱柱存在危害，而单磺酰氯试剂的价格昂贵，而邻苯二甲醛则安全、方便、成本低。作为本专利技术方法的一种改进，海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定方法包括以下步骤：(1)将海洋生物体的组织样品洗净、匀浆、离心并保留上清液；(2)向定量体积的上清液中加入1～1.2倍体积的磺基丙氨酸溶液、0.2～0.24倍体积的磷酸吡哆醛溶液，然后35～39℃下震荡反应1～3h得到反应液，将反应液煮沸灭酶活性5～10min；(3)向定量体积的反应液中加入等体积的衍生化试剂并加热震荡反应，过滤得到测试液；(4)经高效液相色谱法建立牛磺酸的浓度与峰面积的标准曲线；(5)将测试液经高效液相色谱法分析并由步骤(4)中的标准曲线得到牛磺酸的浓度；(6)由步骤(5)中牛磺酸的浓度计算出半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力。上清液中的半胱亚磺酸脱羧酶在磷酸吡哆醛的存在下并经进一步脱氢反应将磺基丙氨酸充分转化成牛磺酸，通过高效液相色谱法建立牛磺酸的浓度与吸光度的标准曲线，进而计算出反应液中转化生成的牛磺酸的量。其中海洋生物包括鱼类、贝类、螺类、虾蟹类、头足类生物，其组织样品包括肉、肝脏、肠、腮等组织。作为本专利技术方法的一种改进，步骤(1)中上清液制备过程如下：将海洋生物的组织样品洗净后置于2～3倍体积的磷酸盐缓冲液中浸润，磷酸盐缓冲液的温度为0～8℃，然后经匀浆机匀浆25～35min并在2～6℃下离心分离，离心机转速为8000～10000rpm/min。充分将海洋生物的组织样品中的半胱亚磺酸脱羧酶分离出来并保持活性。作为本专利技术方法的一种改进，步骤(3)中的震荡频率为100～140rpm/min，反应温度35～39℃，反应时间为1～5min，滤膜的孔径为0.22μm。反应时间短会使牛磺酸与衍生化试剂反应不完全，反应时间长则导致半胱亚磺酸的衍生产物分解，造成测试偏差。作为本专利技术方法的一种改进，步骤(4)中建立牛磺酸浓度与峰面积的标准曲线包括以下步骤：步骤一：配制牛磺酸的标准溶液；步骤二：向牛磺酸的标准溶液中分别添加定量的衍生化试剂并震荡反应得到混合液；步骤三：将混合液经滤膜过滤后送入高效液相色谱中分析，得到以牛磺酸的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标的标准曲线。选择合适的牛磺酸的标准溶液的浓度，使牛磺酸的浓度与峰面积具有良好的线性关系，得到的线性方程的拟合优度系数不低于0.995。作为本专利技术方法的一种改进，步骤一中牛磺酸的标准溶液经定量的牛磺酸溶于磷酸盐缓冲液中定容制成。与上清液的制备保持一致。作为本专利技术方法的一种改进，步骤二中牛磺酸与邻苯二甲醛的摩尔比为0.3～2:1。在该比例范围内的牛磺酸与邻苯二甲醛的衍生反应完全，峰面积好。作为本专利技术方法的一种改进，高效液相色谱检测的参数如下：色谱柱为AgilentEclipseXDB-C18，流动相分别为乙腈与水，其中乙腈的体积为10％～60％，流动相的流速为0.2～0.8mL/min，波长为360nm。牛磺酸具有良好的分离效果，出峰时间短，为3.5～3.8min，牛磺酸的峰型与相邻峰能够实现完全分离。本专利技术的有益效果如下：本专利技术的海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定方法，可以准确、简洁、安全的测定海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力，而且检测成本低，同时也可以用于其他动物体内的半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定方法，其特征在于，从海洋生物体的组织样品中分离出含半胱亚磺酸脱羧酶的溶液，在合适的反应条件下将加入的磺基丙氨酸转化成牛磺酸，测定生成的牛磺酸的含量，进而计算半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力。

【技术特征摘要】
1.一种海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定方法，其特征在于，从海洋生物体的组织样品中分离出含半胱亚磺酸脱羧酶的溶液，在合适的反应条件下将加入的磺基丙氨酸转化成牛磺酸，测定生成的牛磺酸的含量，进而计算半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力。2.根据权利要求1所述的海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定方法，其特征在于，测定生成的牛磺酸的含量包括以下步骤，首先向含牛磺酸的溶液中加入合适的衍生化试剂，然后经高效液相色谱法测定衍生物的浓度。3.根据权利要求2所述的海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定方法，其特征在于，所述衍生化试剂经以下过程制备而成：向1mL的甲醇中溶解0.01g的邻苯二甲醛，再加入0.01mL的乙硫醇混合，然后用0.4mol/L的硼酸钠缓冲液定容至10mL得到衍生化试剂。4.根据权利要求1或2或3所述的海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测定方法，包括以下步骤：（1）将海洋生物体的组织样品洗净、匀浆、离心并保留上清液；（2）向定量体积的上清液中加入1～1.2倍体积的磺基丙氨酸溶液、0.2～0.24倍体积的磷酸吡哆醛溶液，然后35～39℃下震荡反应1～3h得到反应液，将反应液煮沸灭酶活性5～10min；（3）向定量体积的反应液中加入等体积的衍生化试剂并加热震荡反应，过滤得到测试液；（4）经高效液相色谱法建立牛磺酸的浓度与峰面积的标准曲线；（5）将测试液经高效液相色谱法分析并由步骤（4）中的标准曲线得到牛磺酸的浓度；（6）由步骤（5）中牛磺酸的浓度计算出半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力。5.根据权利要求4所述的海洋生物体内半胱亚磺酸脱羧酶的酶活力的测...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳小英，毛丽沙，鲍敏洁，金火喜，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33