一种基于母体的胎儿外膜滋养层细胞的胎儿遗传检测方法技术

本发明专利技术公开一种基于母体的胎儿外膜滋养层细胞的胎儿遗传检测方法，包括如下步骤：1)提供含有胎儿滋养层细胞的样本；2)将样品固定，加冰醋酸消化，离心，缓冲液重悬，姨酶消化，缓冲液重悬；3)加入磁性纳米颗粒偶联的HLA‑G单克隆抗体，孵育；4)磁力架收集，缓冲液冲洗离心，纯化磁性纳米颗粒捕获的细胞；5)DNA酶处理，挑取单个细胞，进行单细胞基因组扩增，对基因组DNA进行打断建库；6)测序分析。本发明专利技术所述方法简便、快速、特异性高。

A fetal genetic detection method based on maternal fetal adventitial trophoblast cells

The invention discloses a method for detecting fetal genetic maternal fetal trophoblast cells based on outer membrane, which comprises the following steps: 1) containing fetal trophoblast samples; 2) samples were fixed, ice acetic acid digestion, centrifugation, resuspended in buffer, aunt of enzymatic digestion, buffer suspension; 3) HLA monoclonal G antibody, adding magnetic nanoparticles conjugated incubation; 4) magnetic frame buffer flushing collection, centrifugation, purified magnetic nanoparticles capture cells; 5) DNA enzyme treatment, from single cell, single cell genome amplification of DNA gene group interrupted 6) sequencing analysis database. The method of the invention is simple, fast and high in specificity.

【技术实现步骤摘要】
一种基于母体的胎儿外膜滋养层细胞的胎儿遗传检测方法
本专利技术涉及诊断学，具体涉及一种基于母体的胎儿外膜滋养层细胞的胎儿遗传检测方法。
技术介绍
胎儿DNA的获得主要有两种方式：一是传统的侵入性方法，包括羊膜穿刺术(amniocentesis)，绒毛膜取样(chorionicvillussampling，CVS)，脐血取样等，这些方法虽能准确地诊断，但可能造成胎儿损伤，导致产妇流产等不良后果，而且在孕期较晚时间(8～20周，或者更晚)才能检测；二是非侵入性方法，非侵入性方法获取胎儿DNA的是从母体血浆和循环的胎儿细胞，在怀孕的早期，可在母体的血液中检测到胎儿的遗传物质的一种基于无细胞的胎儿游离DNA(cfDNA)开发的非侵入性诊断策略，然而，根据研究分析，在妊娠的早期和妊娠晚期，cfDNA分别仅占总血浆DNA的大约3.4％和6.2％，而且，其含量受到孕妇的年龄，体重，怀孕的时间影响，此外，cfDNA是短片段的DNA，这对精确的分析来说是很大的挑战。另外一种技术是基于母体血液的胎儿有核红细胞，以及评估获取细胞的核苷酸序列。在母体样本中富集胎儿有核红细胞的方法中：首先，通过密度梯度离心，去除母体血液中多种无核的细胞，之后通过亲和力的原理富集与纯化胎儿有核红细胞；例如，有核红细胞的前体细胞表面大量表达半乳糖分子，其可被凝集素捕获；此外，可利用细胞表面特异性的抗原，富集胎儿有核红细胞；例如，胎儿有核红细胞大量表达基质金属蛋白酶14前体或转铁蛋白前体。但该细胞在血液中的含量非常稀少，在106～107的母体细胞中可能只含有1个胎儿的有核红细胞，这对于分离来说，是非常困难，而且这些方法只能在孕期较晚时间(12～26周)才能检测，存在局限性。评估获取细胞的核苷酸序列方法中：评估富集胎儿细胞的核苷酸序列的包括：靶核苷酸测序方法和基因组DNA测序、使用特定的检测探针与感兴趣的序列杂交、细胞里某些基因RNA表达水平的评估等。目前广泛使用的三种检测方法存在局限性：羊水穿刺术和绒毛膜绒毛取样(CVS)技术具有侵入性，而且在孕期较晚时间(8～20周，或者更晚)才能检测；胎儿游离DNA(cfDNA)检测存在胎儿DNA含量过低的问题，而且在孕期较晚时间(12～26周)才能检测。此外，基于母体血液的胎儿有核红细胞的方法，但该细胞在血液中的含量非常稀少，在106～107的母体细胞中可能只含有1个胎儿的有核红细胞，这对于分离来说，是非常困难。在胚胎发育成桑椹胚后，桑椹胚进一步发育，细胞开始出现分化。聚集在胚胎的一端，个体较大的细胞，称为内细胞团(innercellmass，ICM)，将来发育成胎儿的各种组织，而沿透明带内壁扩展和排列的，个体较小的细胞，称为滋养层细胞，它们将来发育成胎膜和胎盘。滋养层细胞有囊胚外围的滋养外胚层发育分化而来，覆盖于绒毛的表面，内层为细胞滋养层细胞，外层为合体滋养层细胞。在胚胎发育过程中，绒毛表面的细胞滋养层细胞不断增加，逐步发育成胎膜和胎盘。近年来，科学家发现有少量的滋养层细胞会迁移到孕妇的子宫颈口。这类细胞保持与胎儿相同的DNA序列，可用于胎儿诊断，但现有技术中的流程需要将HLA-G的抗体与磁珠上的二抗过夜孵育，流程繁琐，耗时，且存在磁珠表面的二抗与样本里面的细胞非特异性结合，降低检测的准确性。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种基于母体的胎儿外膜滋养层细胞的胎儿遗传检测方法。本专利技术所述方法简便、快速、特异性高。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术手段为：一种基于母体的胎儿外膜滋养层细胞的胎儿遗传检测方法，包括如下步骤：1)提供含有胎儿滋养层细胞的样本；2)将样品固定，加冰醋酸消化，离心，缓冲液重悬，胰酶消化，缓冲液重悬；3)加入磁性纳米颗粒偶联的HLA-G单克隆抗体，孵育；4)磁力架收集，缓冲液冲洗离心，纯化磁性纳米颗粒捕获的细胞；5)DNA酶处理，挑取单个细胞，进行单细胞基因组扩增，对基因组DNA进行打断建库；6)测序分析。本专利技术还提供一种胎儿外膜滋养层细胞的纯化方法，包括以下步骤：1)提供含有胎儿滋养层细胞的样本；2)将样品固定，加冰醋酸消化，离心，缓冲液重悬，胰酶消化，缓冲液重悬；3)加入磁性纳米颗粒偶联的HLA-G单克隆抗体，孵育；4)磁力架收集，缓冲液冲洗离心，纯化磁性纳米颗粒捕获的细胞。本专利技术还提供所述胎儿外膜滋养层细胞的纯化方法在胎儿遗传中的应用。本专利技术步骤1)所述的样品，妊娠5周或5周以上即可获得，可以通过巴氏涂片获得含有完整的胎儿滋养层细胞的母体(孕妇)宫颈管的样本；更具体的，可以将细胞刷深入到宫颈内管大约2cm，并旋转360度；如果第一次没有得到宫颈黏液，可再次采集样本。尽量减少与宫颈壁接触，以减少母亲的细胞的污染。本专利技术步骤2)样品固定可以用本领域常用的细胞固定液，如：95％的乙醇、甲醇、5％的冰醋酸、Carnoy固定液(配方：无水乙醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml)、丙酮、4％的多聚甲醛溶液、10％的甲醛溶液等；优选Carnoy固定液，Carnoy固定液能固定胞浆和胞核，尤其适宜于染色体等。本专利技术步骤2)所采用的具体方法可以为：将采集到的样品转移到固定液中，加入冰醋酸，室温放置4-6min；离心去上清，缓冲液清洗，离心去上清，缓冲液重悬，加入胰酶35-38℃消化10-20min，离心去上清，缓冲液重悬。本专利技术步骤2)中离心选用的条件优选为1000-2000rpm离心4-6min；缓冲液优选PBS。步骤2)中加冰醋酸可以消化样本的黏液，同时使红细胞膨胀而破碎。加胰酶的处理有利于消化成单个细胞，便于后面的质控以及细胞捕获实验。本专利技术步骤3)中的HLA-G单克隆抗体为兔源HLA-G单克隆抗体。本专利技术步骤4)纯化磁性纳米颗粒捕获的细胞之后，可以取部分细胞，质控富集细胞的纯度。质控方法可以为本领域常用的方法，如：取部分富集细胞转移到载玻片上，38-42℃处理样本4-6min，按照免疫荧光的方法，用Cy3偶链的hCG的抗体检测细胞是否表达hCG(正常情况下，凡是表达HLA-G的细胞都会表达hCG)，质控富集细胞的纯度。本专利技术步骤5)DNA酶处理可以消化外源的母体DNA，避免母体细胞DNA的影响，具体方法可以为：DNA酶室温处理4-6min。本专利技术的步骤5)挑取单个细胞，裂解细胞，之后用DNA聚合酶扩增基因组。优选高保真的DNA聚合酶。可以是耐热的高保真DNA聚合酶，也可以是常温的DNA聚合酶。本专利技术一种更为具体的基于母体的胎儿外膜滋养层细胞的胎儿遗传检测方法，包括以下步骤：1)妊娠5周或5周以上的孕妇，利用巴氏涂片捕获得含有完整的胎儿滋养层细胞的孕妇宫颈管的样本；2)将步骤1)捕获的细胞转移到细胞固定液中，3-5℃保存；向样本中加入冰醋酸，室温放置4-6min，1000-2000rpm离心4-6min收集细胞样本；3)缓冲液重悬细胞样本，离心，去上清，重复3次；4)缓冲液重悬细胞样本，加入胰酶35-37℃消化处理细胞10-20min，1000-2000rpm离心4-6min收集细胞样本；5)缓冲液重悬细胞样本，离心，去上清，重复3次；6)加入磁性纳米颗粒偶联的HLA-G单克隆抗体，3-5℃孵育过夜；7)磁力架收集之后再用冷的缓冲液重悬，重复收集-重悬3次，纯化磁性纳米颗粒捕获的细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于母体的胎儿外膜滋养层细胞的胎儿遗传检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)提供含有胎儿滋养层细胞的样本；2)将样品固定，加冰醋酸消化，离心，缓冲液重悬，胰酶消化，缓冲液重悬；3)加入磁性纳米颗粒偶联的HLA‑G单克隆抗体，孵育；4)磁力架收集，缓冲液冲洗离心，纯化磁性纳米颗粒捕获的细胞；5)DNA酶处理，挑取单个细胞，进行单细胞基因组扩增，对基因组DNA进行打断建库；6)测序分析。

【技术特征摘要】
1.一种基于母体的胎儿外膜滋养层细胞的胎儿遗传检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)提供含有胎儿滋养层细胞的样本；2)将样品固定，加冰醋酸消化，离心，缓冲液重悬，胰酶消化，缓冲液重悬；3)加入磁性纳米颗粒偶联的HLA-G单克隆抗体，孵育；4)磁力架收集，缓冲液冲洗离心，纯化磁性纳米颗粒捕获的细胞；5)DNA酶处理，挑取单个细胞，进行单细胞基因组扩增，对基因组DNA进行打断建库；6)测序分析。2.根据权利要求1所述的胎儿遗传检测方法，其特征在于，步骤1)所述含有胎儿滋养层细胞的样本为妊娠5周或5周以上母体的宫颈管样本。3.步骤2)样品固定是通过细胞固定液进行固定，所述固定液为95％的乙醇、甲醇、5％的冰醋酸、Carnoy固定液、丙酮、4％的多聚甲醛溶液或10％的甲醛溶液；优选Carnoy固定液。4.根据权利要求1所述的胎儿遗传检测方法，其特征在于，步骤2)所采用的具体方法为：将采集到的样品转移到固定液中，加入冰醋酸，室温放置4-6min；离心去上清，缓冲液清洗，离心去上清，缓冲液重悬，加入胰酶35-38℃消化10-20min，离心去上清，缓冲液重悬。5.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹林，张力军，聂俊伟，瞿志鹏，韩锦雄，齐心，曲若端，
申请(专利权)人：南京诺唯赞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32