用于诊断阿耳茨海默氏病(AD)的方法技术

公开了一种用于诊断阿耳茨海默氏病(AD)的方法，其中检测怀疑具有AD的人的生物学样品中的Aβ特异性抗体，其包括下列步骤：-使所述样品与Aβ聚集体或与具有Aβ聚集体样表面的颗粒接触，并且容许所述Aβ特异性抗体结合所述Aβ聚集体，并-通过单一颗粒检测技术(single particle detection technique)，优选通过荧光活化细胞分选(FACS)检测与所述Aβ聚集体结合的所述Aβ特异性抗体；且其中与已知AD状态的样品中的量比较检出的Aβ特异性抗体的量。

Methods for the diagnosis of A Letsheimers's disease (AD)

A diagnosis of A Letsheimers's disease (AD) method, the detection of suspected A beta specific antibodies in biological samples with AD in the US, which comprises the following steps: - that the sample with A beta aggregates or with A aggregates like beta particles at the surface contact, and allow the A beta specific antibody binding to the A beta and aggregates, through single particle detection technology (single particle detection technique), preferably by fluorescence activated cell sorting (FACS) of the A beta specific antibody detection and the A combined with the A beta beta aggregates; specific antibody which with known AD the sample quantity in the detection of the amount of.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及用于检测生物学样品中的Aβ特异性抗体及的方法，尤其与阿耳茨海默氏病(Alzheimer’sdisease,AD)有关及用于诊断阿耳茨海默氏病。AD是一种复杂的进行性病症，其牵涉使病理学级联，包括脑中的淀粉状蛋白-β聚集和斑形成，tau蛋白的超磷酸化(hyperphosphorylation)与神经元内缠结的形成相互作用。伴随这些脑蛋白质的聚集和超磷酸化，炎性过程促成突触完整性的丧失和进行性神经变性。淀粉状蛋白β肽(Aβ或A-beta)从具有主要为alpha-螺旋或无规卷曲二级结构的可溶性形式转化成具有beta-片层二级结构的聚集形式(其最终在脑中形成淀粉状蛋白斑)代表AD病理学的第一标志之一。Aβ的几种形式，即C及N端截短的或经修饰的肽促成脑中的Aβ斑形成。Aβ的三种主要C端变体包括肽Aβ1-40(由40个氨基酸(aa)组成，Val-40为最后一个aa)，Aβ1-42，和Aβ1-43。除了C端截短肽的这些主要形式外，还存在不太频繁出现的其它截短形式，即Aβ1-37，Aβ1-38，和Aβ1-39。Aβ的N端变体由Aβ3-40/42/43和Aβ11-40/42/43组成。在所有这些N端截短形式中，谷氨酸占据第一个位置。此aa不是稳定的，而是经历变化以建立焦谷氨酸(pE)，导致形成Aβp(E)3-40/42和Aβp(E)11-40/42。pE残基自发形成或者通过称为谷氨酰基环化酶的酶酶促形成。直到最近，AD的诊断是完全临床诊断，其基于至少两个领域(例如认识，功能)的认知缺陷的逐渐发生，这在没有另一种可辨别原因(例如血管)的情况中负面影响患者的日常生活。AD的临床诊断的限制是误诊的高比率(专家为80%诊断特异性)和如下的实情，即仅可以在疾病已经停止导致功能性缺陷的实质性神经元丧失的晚期时间点时做出诊断。基于经过过去20年搜集的知识，诊断AD的方式在快速变化。一组由B.Dubois（巴黎）领导的研究人员第一次整合数据，其已经从调查出现AD根本的病理学，出现诊断性算法(Dubois等,LancetNeurol.9(2010):1118-1127)。依照作者，AD的诊断基于特定的认知缺陷(情景记忆的变化)，其必须与疾病特异性生物标志物的变化(如通过结构MRI评估的海马萎缩；AD典型的脑脊液标签(signature)(低A42，高总tau，高磷酸Tau)；阳性淀粉状蛋白成像；限定的遗传风险)组合发生。最近，NIH-NINCDS工作组已经很大程度上采用此病理生理学驱动的诊断算法(McKhann等,Alzheimer’s&Dementia7(2011):263-269)。主要出于实际目的，NIHNINCDS工作组保留AD型的MCI(轻度认知损伤)为AD的早期阶段的诊断。由国立老龄化研究所(NationalInstituteofAging)(NIA,NIH,USA)和阿尔茨海默协会(AlzheimerAssociation)任命的工作组已经采用如下的观念，即依靠反映疾病病理学的生物标志物增强AD的临床诊断。通过这样做，AD不再是通过排除进行的诊断，而是开始为正面诊断。NIA和AA没有完全遵循由Dubois及同事提出的生物标志物驱动的算法的实情反映目前可用的生物标志物的限制。AD脑脊液(CSF)标签可以作为一个例子讨论。AD患者的CSF显示典型的样式，即Aβ1-42的降低和总Tau(tTau)和磷酸Tau(pTau)的升高。标签存在于AD患者中，但是没有随时间检出变化。实际上，在有AD风险的患者(即MCI患者)群体中，其鉴定出继续形成临床症状的人。已经处于所述阶段，CSF显示与在充分发展的AD患者中相同的表达样式和变化量。如此，虽然不可能限定Aβ1-42、tTau和pTau的正常范围，但是没有定义转折点，即给定患者中例如Aβ生理学从正常转化成病理学的时刻。任何目前遵循但尚未确认的生物标志物也就是如此。这点的主要原因是仅有几项评估此问题的纵向研究，因为由于它们对患者造成的风险和/或与其关联的成本而不可能容易地重复CSF、MRI、淀粉状蛋白成像检查。如此，仍然缺乏可以以低风险和成本重复应用的可靠生物标志物。由于至今开发基于血液的生物标志物耗费的全部努力失败，情况尤其如此(Hampel等,Nat.Rev.DrugDiscov.9(2010):560-574)。此类生物标志物的利用度对于疾病缓解疗法的开发会是最重要的。此类疗法施用得越早，成功的机会越大。而且，可以将此类努力限于借助于特定生物标志物鉴定的真正AD病例。至今，已经在AD和MCI(AD的痴呆前阶段)中评估了Aβ(测试的各种Aβ种类和聚集体状态)。最近的发现显示了存在有AD患者和健康对照的血浆和脑脊液中含有的IgG和IgM的抗促淀粉状变(amyloidogenic)活性(O’Nuallain等,J.Clin.Immunol.30(2010)Suppl.1:S37-S42;Marcello等,JNeural.Transm.116(2009):913-920)。通过评估对各种Aβ形式/聚集状态特异性的IgG和/或IgM的ELISA或免疫沉淀测定法获得的结果显示了AD和MCI患者比健康对照展现出更低水平的血清Aβ自身抗体。虽然这些研究显示了自身抗体浓度的差异，使用的方法缺乏灵敏性和特异性，其对于使用它们作为以高选择性和特异性鉴定AD或MCI患者的预测性诊断工具会是必需的。至今使用的大多数方法基于ELISA技术。为了提高这些测定法的灵敏性，一些方法使用Aβ1-42肽的放射性标记。用经氯胺T标记的Aβ1-42使用免疫沉淀测定法来测量健康对照和AD患者之间的差异，Brettschneider等,(Brettschneider等,Biol.Psychiatry57(2005):813-817)的ROC(接收器工作特性)分析在灵敏性设置为81.3%时达到46.7%的特异性。比较而言，Bayer等(WO2010/128139A1;Marcello等,JNeural.Transm.116(2009):913-920)使用基于ELISA的方法，其中将焦谷氨酸-Aβ片段在板上包被。在此情况中，用抗IgM-HRP抗体检测健康对照和AD患者中的抗Aβ特异性IgM-自身抗体显示了在灵敏性设置为80%时特异性是60%。至今，这些方法无一满足会使它们符合作为AD的预测性生物标志物(>80%特异性)的标准。不知道这两组患者中降低的Aβ特异性抗体血清浓度的原因。有两种一般本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于诊断阿耳茨海默氏病(AD)的方法，其中检测怀疑具有AD的人的生物学样品中的Aβ特异性抗体，其包括下列步骤：‑使所述样品与Aβ聚集体或与具有Aβ聚集体样表面的颗粒接触，并且容许所述Aβ特异性抗体结合所述Aβ聚集体，并‑通过单一颗粒检测技术(single particle detection technique)，优选通过荧光活化细胞分选(FACS)检测与所述Aβ聚集体结合的所述Aβ特异性抗体；且其中将检出的Aβ特异性抗体的量与已知AD状态的样品中的量比较。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.10.04 EP 11183842.11.一种用于诊断阿耳茨海默氏病(AD)的方法，其中检测怀疑具有AD的
人的生物学样品中的Aβ特异性抗体，其包括下列步骤：
-使所述样品与Aβ聚集体或与具有Aβ聚集体样表面的颗粒接触，并且容
许所述Aβ特异性抗体结合所述Aβ聚集体，并
-通过单一颗粒检测技术(singleparticledetectiontechnique)，优选通过荧
光活化细胞分选(FACS)检测与所述Aβ聚集体结合的所述Aβ特异性抗体；
且其中将检出的Aβ特异性抗体的量与已知AD状态的样品中的量比较。
2.依照权利要求1的方法，其特征在于所述Aβ特异性抗体是人抗体，优
选人IgG或IgM抗体，特别是人IgG抗体。
3.依照权利要求1或2的方法，其特征在于所述Aβ特异性抗体是自身抗
体。
4.依照权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于所述Aβ聚集体具有
50nm至15μm，优选100nm至10μm，尤其是200nm至5μm的大小。
5.依照权利要求1至4中任一项的方法，其特征在于所述Aβ聚集体已经
通过于2至9的pH将Aβ-1-42肽，Aβ-1-43肽，Aβ-3-42，或Aβ-p(E)3-42肽温育
至少20分钟，优选至少1小时，尤其是至少4小时制备。
6.依照权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于所述Aβ聚集体以
0.001至1μM，优选0.01至0.1μM的量存在，用于使所述样品与Aβ聚集体接触。
7.依照权利要求1至6中任一项的方法，其特征在于所述生物学样品是人
血液或自人血液衍生的样品，优选人血清或人血浆；人脑脊液或人淋巴。
8.依照权利要求1至7中任一项的方法，其特征在于使所述Aβ聚集体与
所述样品接触至少10分钟，优选10分钟至24小时，尤其是20分钟至2小时。
9.依照权利要求1至8中任一项的方法，其特征在于在使所述样品与Aβ
聚集体接触前对所述样品中的所述Aβ特异性抗体实施解蔽步骤，尤其在检测
IgM抗体时。
10.依照...

【专利技术属性】
技术研发人员：G斯塔夫勒，A梅尔霍弗，A施内伯格，M卢特罗瓦，W施密特，F马特纳，
申请(专利权)人：阿费里斯股份公司，
类型：发明
国别省市：奥地利;AT