融合蛋白、重组细菌和使用重组细菌的方法技术

提供融合蛋白，含有使所述融合蛋白靶向蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。还提供表达这种融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员。还提供过表达外孢壁蛋白的基因灭活的蜡样芽胞杆菌家族成员和重组蜡样芽胞杆菌家族成员。还提供使用重组蜡样芽胞杆菌家族成员包覆的种子和用于使用的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的方法(例如用于刺激植物生长)。还提供表达所述融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的各种修饰。还提供包含孢子外壳蛋白和目标蛋白或肽的融合蛋白、表达这种融合蛋白的重组细菌、使用这种重复细菌包覆的种子、和用于使用这种重组细菌的方法(例如用于刺激植物生长)。

Fusion proteins, recombinant bacteria, and methods of using recombinant bacteria

A fusion protein comprising a targeting sequence of an outer spore wall of a member of the Bacillus cereus family, an outer wall protein, or an outer wall protein fragment is provided. A member of the recombinant Bacillus cereus family expressing the fusion protein is also provided. A member of the Bacillus cereus family and a recombinant Bacillus cereus family expressing inactivation of the gene for expression of the outer wall protein are also provided. Methods are provided for using recombinant coated Bacillus cereus family members and for members of recombinant Bacillus cereus family members (for example, to stimulate plant growth). Various modifications of members of the recombinant Bacillus cereus family expressing the fusion protein are also provided. Contain spore coat protein and target protein or peptide fusion protein, the expression of the fusion protein of recombinant bacteria, using the bacteria coated seeds, repeat and method for using this recombinant bacteria (e.g. for stimulating plant growth).

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】融合蛋白、重组细菌和使用重组细菌的方法相关申请的交叉引用本申请要求2014年9月17日提交的美国临时专利申请序列号62/051,885的权益，其全部以引用的方式并入本文。参考电子提交的序列表序列表的正式副本以电子方式通过EFS-Web作为ASCII格式的序列表提交，文件名为“3005.WO基因序列表.txt”，文件名为“3005.WO基因序列表.txt”，大小为488千字节，并且与说明书同时提交。该ASCII格式的文档中包含的序列表是说明书的一部分，其全部内容通过引用并入本文。
本专利技术通常涉及融合蛋白，含有使所述融合蛋白靶向蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。本专利技术还涉及表达这种融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员、含有重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂、使用重组蜡样芽胞杆菌家族成员包覆的种子、和用于使用重组蜡样芽胞杆菌家族成员的方法(例如用于刺激植物生长、保护植物免受病原体侵害、提高植物的胁迫抗性、在植物上固定重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子、刺激植物种子的发芽、和将核酸递送至植物)。本专利技术还涉及过表达蛋白酶或核酸酶的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中蛋白酶或核酸酶的过表达部分或完全灭活蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子，或使孢子更易于物理或化学灭活。本专利技术进一步涉及过表达外孢壁蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员、使用这种重组蜡样芽胞杆菌家族成员包覆的种子、和用于使用重组蜡样芽胞杆菌家族成员的方法(例如用于刺激植物生长、提高植物的胁迫抗性和保护植物免受病原体侵害)。本专利技术进一步涉及表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的各种修饰，包括：(i)在重组蜡样芽胞杆菌成员中调节融合蛋白的表达的调节子蛋白的过表达；(ii)重组蜡样芽胞杆菌家族成员的基因灭活；和(iii)允许含有融合蛋白的外孢壁片段收集的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的突变或其他基因改变。本专利技术还涉及用于使用外孢壁片段的各种方法。本专利技术进一步涉及包含孢子外壳蛋白和目标蛋白或肽的融合蛋白、表达这种融合蛋白的重组细菌、使用这种重复细菌包覆的种子和用于使用这种重组细菌的方法(例如用于刺激植物生长、保护植物免受病原体侵害、提高植物的胁迫抗性、在植物上固定重组细菌孢子、刺激植物种子的发芽、和将核酸递送至植物)。本专利技术进一步涉及细菌的新型菌株的生物学纯细菌培养基。本专利技术另外涉及使用下面包覆的植物种子：催化一氧化氮或超氧化物歧化酶产生的酶、或过表达催化一氧化氮或超氧化物歧化酶的酶的重组孢子-形成细菌。本专利技术还涉及用于将有益细菌和酶或疫苗递送至动物的方法、和其他使用方法。
技术介绍
植物根部周围的区是被称为根际的区域。在根际中，细菌、真菌及其他有机体竞争营养素并且结合至植物的根结构。有害和有益细菌及真菌两者可占据根际。细菌、真菌及植物的根系都可能受到根际中的肽、酶及其他蛋白质的作用的影响。用这些肽、酶或其他蛋白质中的某些来加强土壤或处理植物将对有益的土壤细菌和真菌的总群体具有有益作用，形成用于植物生长的更健康的总体土壤环境，改善植物生长，并且提供植物针对某些细菌和真菌病原体的保护。然而，早先将肽、酶及其他蛋白质引入土壤中以诱发对植物的这种有益作用的努力受到了酶、蛋白质及肽在土壤中的低存活率的阻碍。另外，天然地存在于土壤中的蛋白酶的流行导致土壤中蛋白质的降解。植物根部周围的环境(根际)是细菌、真菌、营养素及根的独特混合体，其具有与原土壤不同的质量。这些有机体之间的共生关系是独特的，并且可被更改以便更好地包含外源性蛋白质。在根际中高浓度的真菌和细菌造成蛋白质甚至更大的降解，这是由于在土壤中异常高水平的蛋白酶及对蛋白质有害的其他元素。另外，被引入土壤中的酶及其他蛋白质可迅速地分散远离植物根部。因此，在本领域中存在对于以下的需要：用于向植物(例如向植物根系)有效地递送肽、酶及其他蛋白质并且延长所述分子保持活性期间的时段的方法。此外，在本领域中存在对以下的需要：具体说来将所述肽、酶及蛋白质选择性地靶向根际以及植物叶片和植物根部的方法。专利技术概述本专利技术的特征在所附权利要求和下面名称为“实施方案”章节中提供的实施方案列表中定义。其他目的和特征将在下文部分明确并部分指出。附图简述图1A和1B显示炭疽杆菌Sterne菌株BclA氨基端部分的氨基酸序列与蜡样芽胞杆菌家族成员多种外孢壁蛋白的相应区域的比对。图2显示含有与mCherry报告基因连接的多种外孢壁蛋白的融合蛋白在重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁上的表达的示例性荧光显微镜结果。图3提供了显示重组苏云金芽孢杆菌BT013A孢子的数据，其中所述孢子表达包含DNA结合蛋白的融合蛋白。图4是显示外孢壁片段和缺失了外孢壁的蜡样芽胞杆菌家族成员孢子的透射电镜显微图，其中所述孢子利用具有CotE基因敲除突变的重组蜡样芽胞杆菌家族成员制备得到。图5是SDS-PAGE凝胶图，其显示蛋白质分子量标准(泳道1)和来自外孢壁片段的蛋白(泳道2)，所述蛋白利用具有CotE基因敲除突变的重组蜡样芽胞杆菌家族成员制备得到。图6提供了阐述来自具有CotE基因敲除突变的蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁片段中酸性磷酸酶的酶活性的数据。图7提供了阐述蜡样芽胞杆菌家族成员EE349减少了除草剂对小扁豆根长度的抑制作用的数据。图8提供了阐述经修饰以过量表达酸性磷酸酶(AcpC)的蜡样芽胞杆菌家族成员中磷酸酶活性增加的数据。图9提供了显示表达CotC-内切葡聚糖酶融合蛋白的重组苏云金芽孢杆菌孢子中内切葡聚糖酶活性的数据。图10提供了显示重组苏云金芽孢杆菌孢子表面上RNA的检测的明场和荧光显微镜图像，其中所述重组苏云金芽孢杆菌孢子表达包含SEQIDNO:1的氨基酸20-35以及结合至单链RNA(ssRNA)或双链RNA(dsRNA)的SspC的融合蛋白。图11提供了显示微小RNAMIR319在利用重组苏云金芽孢杆菌孢子递送至大豆植株中后对大豆高度和根发育的影响的图，其中所述重组苏云金芽孢杆菌孢子表达包含SEQIDNO:1的氨基酸20-35以及结合至MIR319的SspC的融合蛋白。图12提供了显示线虫的肠中GFP和mCherry的检测的明场和荧光显微镜图像，其中所述线虫饲喂正常的OP50大肠杆菌细菌食品(右侧2幅图)或者饲喂苏云金芽孢杆菌孢子(左侧3幅图)，所述苏云金芽孢杆菌孢子表达包含SEQIDNO:1的氨基酸20-35以及GFP或mCherry的融合蛋白。图13提供了显示对从经苏云金芽孢杆菌EE-B00184处理的玉米植株内部分离得到的内生细菌进行检测的荧光显微镜图像，其中所述苏云金芽孢杆菌EE-B00184表达包含SEQIDNO:1的氨基酸20-35和GFP的融合蛋白。箭头指示单个孢子。图14提供了显示含有重组蜡样芽胞杆菌家族成员的细菌菌落荧光的图，其中所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员表达包含SEQIDNO:1的氨基酸20-35和GFP的融合蛋白，其从由涂覆了重组细菌的种子生长得到的玉米植株内部分离。图15提供了透射电镜显微图，其显示：(A)苏云金芽孢杆菌BT013A的完整孢子，其被附着的外孢壁包围；(B)苏云金芽孢杆菌BT013ACotE敲除菌株的孢子，其具有分开的外孢壁；和(C)外孢壁片段的经纯化的外孢壁片段制备品，其来自苏云金芽孢杆菌BT013AC本文档来自技高网...

【技术保护点】
表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，所述融合蛋白包含：至少一种目标蛋白或肽；以及使所述融合蛋白靶向所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段；其中所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含突变或表达蛋白，其中相比于在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中蛋白的表达，所述蛋白的表达增强，并且其中所述蛋白的突变或增强的表达导致具有这样外孢壁的蜡样芽胞杆菌孢子，该外孢壁相比于野生型孢子的外孢壁更容易从所述孢子除去。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.17 US 62/051,8851.表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，所述融合蛋白包含：至少一种目标蛋白或肽；以及使所述融合蛋白靶向所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段；其中所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含突变或表达蛋白，其中相比于在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中蛋白的表达，所述蛋白的表达增强，并且其中所述蛋白的突变或增强的表达导致具有这样外孢壁的蜡样芽胞杆菌孢子，该外孢壁相比于野生型孢子的外孢壁更容易从所述孢子除去。2.表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，所述融合蛋白包含：至少一种目标蛋白或肽；以及使所述融合蛋白靶向所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段；其中所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员：(i)包含CotE基因中的突变；(ii)表达ExsY蛋白，其中相比于在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中ExsY蛋白的表达，ExsY蛋白的表达增强，并且其中所述ExsY蛋白包含含有球状蛋白的羧基端标签；(iii)表达BclB蛋白，其中相比于在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中BclB蛋白的表达，BclB蛋白的表达增强；(iv)表达YjcB蛋白，其中在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于YjcB蛋白的表达，YjcB蛋白的表达增强；(v)包含ExsY基因中的突变；(vi)包含CotY基因中的突变；(vii)包含ExsA基因中的突变；或(viii)包含CotO基因中的突变。3.权利要求1或2所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员包括CotE基因中的突变。4.权利要求3所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中CotE基因中的突变包含CotE基因或CotE基因的显性阴性形式的敲除。5.权利要求1-4中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员表达ExsY蛋白，其中在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于ExsY蛋白的表达，ExsY蛋白的表达增强，并且其中所述ExsY蛋白包含含有球状蛋白的羧基端标签。6.权利要求5所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中所述球状蛋白的分子量为25kDa至100kDa。7.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·汤普森，A·西格尔，
申请(专利权)人：斯波根生物技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US