自然杀伤细胞的方法和组合物技术

本发明专利技术公开了用于刺激和产生或扩增自然杀伤(NK)细胞的新颖组合物和方法。与用一种或多种刺激肽修饰的外来体接触后，NK细胞的数目可增加。本发明专利技术还描述了用于生产外来体的方法和组合物，其中所述外来体包括刺激肽。本发明专利技术还描述了使用所公开的刺激NK的外来体或用所公开的方法刺激过的NK细胞来治疗癌症的方法。

Methods and compositions for natural killer cells

Novel compositions and methods for stimulating and producing or amplifying natural killer (NK) cells are disclosed. The number of NK cells increases with exposure to foreign bodies modified with one or more stimulating peptides. The present invention also describes methods and compositions for producing foreign bodies, wherein the foreign body includes stimulating peptides. The present invention also describes methods for treating cancer by using an open NK stimulus or by using an open method of stimulating NK cells.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】自然杀伤细胞的方法和组合物相关专利申请的交叉引用本申请要求提交于2014年10月27日的美国临时申请62/069,057的权益，该美国临时申请由此全文以引用方式并入本文。
本申请整体涉及包含自然杀伤(NK)细胞的组合物和方法。更具体地，本申请涉及对能够攻击和杀伤癌细胞、病毒感染细胞和某些免疫细胞的内源性自然杀伤(NK)细胞的体内、离体或体外刺激和扩增。
技术介绍
来自遗传型上HLA匹配的同胞的造血干细胞移植(HSCT)已经改善了患有血液癌症恶性肿瘤和骨髓衰竭综合征的患者的长期存活。每年，有超过10,000名美国人患上危及生命的疾病，该等疾病的唯一治愈希望就是从不相关的供体或脐血单位(cordbloodunit)进行骨髓移植。然而，可以从同种异体干细胞移植受益的患者中超过70％没有匹配的同胞供体。这些情况会延迟治疗，因此有必要诉诸不太理想地使用部分不匹配的供体，这最终导致移植物抗宿主病(GVHD)、移植失败和复发的发生率增大，所有这些都显著降低了患者的存活。移植过程的持续时间和昂贵的经济、精神和健康负担造成了附加限制。因此，来自不相关供体的HSCT的应用仅限于具有能够持续该过程的适当社会经济支持的较年轻、较健康的患者。由于无法根除残留的癌细胞，高复发率引起了进一步的挑战。虽然HSCT被认为是治愈性的，但癌症复发率是大的惊人的。因此，需要更具靶向性的新颖免疫疗法，所述免疫疗法将更有效，优选地不需要匹配的供体。在20世纪90年代引入了供体淋巴细胞输注(DLI)，以用于治疗HSCT后的急性骨髓性白血病(AML)复发。这种方法由以下步骤组成：从原始供体向患有复发疾病的AML患者施用淋巴细胞。然而，临床益处是有限的并仅在少数具有较小肿瘤负荷的患者中观察到，并且T细胞介导的GVHD常常进一步恶化结局。迫切需要旨在增加NK细胞数量的具改善的新方法。所公开的方法和组合物的另外优点将部分地在下面的描述中阐述，并且将部分地从描述中理解，或者可以通过实践所公开的方法和组合物习得。所公开的方法和组合物的优点将通过所附权利要求书中特别指出的要素和组合来实现和获得。应当理解，上述一般描述和以下详细描述仅仅是示例性和说明性的，并不限制所要求保护的本专利技术。
技术实现思路
本文公开了用于增强自然杀伤(NK)细胞的活性的具改善技术的方法。在某些实施方案中，本文公开的方法导致NK细胞的数目增加。在某些实施方案中，本文公开的方法导致具有改善活性的NK细胞。在某些实施方案中，本文公开的方法导致具有改善活性的NK细胞的数目增加。本文公开了用于增加NK细胞数目的方法，其包括使至少一个NK细胞与至少一种刺激NK的外来体接触，刺激NK的外来体包含存在于外来体膜中的一种或多种刺激肽。外来体可以是体外产生的外来体分泌细胞的细胞外产物。在一些情况下，外来体从饲养细胞分泌。在一些方面，存在于外来体膜中的一种或多种刺激肽可以包括4-1BBL、IL-2、IL-12、IL-18、IL-21、MICA/B、ULBP2、ICAM-1、2B4、BCM1/SLAMF2、CD155、CD112、CCR7和/或其他归巢受体、DAP12、DAP10和/或其他衔接蛋白。在一些情况下，外来体膜不含有IL-15。在一些方面，存在于外来体膜中的所述一种或多种刺激肽包括4-1BBL和IL-21。刺激肽也可以与一个或多个膜插入肽偶联。膜插入肽可以包含对脂质双层具有亲和力的CD4或IgG的区段。或者，膜插入肽可以包括人Fc、GPI、跨膜T细胞受体，或pHLIP。与一个或多个膜插入肽偶联的所述一种或多种刺激肽可以包括由重组DNA编码的融合蛋白。在一些实施方案中，外来体是由与NK细胞共培养的饲养细胞产生的。与当前共培养方法相关的一个缺点是污染的可能性。然而，由于使用所公开的方法时，饲养细胞和NK细胞之间无需直接的细胞间接触，所以所述细胞可以用尺寸设定为允许外来体通过的膜分离。因此，本文还公开了一种生物反应器，该生物反应器包括由尺寸设定为允许外来体通过的膜分离的饲养细胞和NK细胞。此类生物反应器可以设计成具有用分子多孔膜分隔的多个隔室，或者为具有允许外来体穿过但不允许细胞穿过的分子多孔膜的中空纤维类型。这种生物反应器设计可以被并入以作为用于细胞活化、细胞生长或细胞处理的更大装置或系统的一部分。本文使用的外来体可以由经工程化以改善外来体表达的细胞系产生。在一些情况下，细胞系是白血病细胞系，诸如K562细胞。在一些情况下，细胞系已经工程化以表达所述一种或多种刺激肽，诸如4-1BBL和IL-21。因此，在一些实施方案中，细胞系包含K562-mb21-41BBL。在一些实施方案中，外来体是由PBMC产生的。在一些情况下，细胞系被艾普斯登-巴尔病毒(Epstein-Barrvirus)感染，诸如EBV-LCL细胞，或被巨细胞病毒感染，或被共感染。可以使NK细胞在体外、体内或离体地与刺激NK的外来体接触或暴露于刺激NK的外来体。例如，可以在同种异体移植手术、单倍体相合移植手术或体内免疫疗法程序中使NK细胞与刺激NK的外来体接触。在一些方面，在同种异体移植、单倍体移植或体内免疫疗法中使用刺激NK的外来体不会引起移植物抗宿主病(GVHD)。在一些方面，NK细胞存在于未经选择的外周血单核细胞(PBMC)的群体中。在一些实施方案中，从受试者分离的全血或PBMC离体地接触所公开的外来体以扩增PBMC内的NK细胞。在一些实施方案中，使外来体与来源于诱导的多能干细胞(IPSC)、PBMC、脐带血、分离的NK祖细胞或它们的任何组合的NK细胞接触。一旦接触，可将全血、PBMC、扩增的NK细胞、分离的NK细胞或去除了其他淋巴样细胞类型的NK细胞产物输回到受试者体内。可以在标准组织培养板或烧瓶、封闭袋系统(例如美天旎公司(Miltenyi)生产的CliniMacsProdigy系统(CliniMacsProdigysystem))、中空纤维装置(TerumoBCT公司生产的量子细胞扩增系统(QuantumCellExpansionSystem))、G-Rex烧瓶(威尔森沃尔夫公司(WilsonWolf))或其他装置中用外来体刺激NK细胞或含有NK细胞的细胞群体以进行激活或扩增。本文公开了用于治疗对NK介导的裂解敏感的细胞的方法，包括向细胞施用有效量的包含经接触的NK细胞的组合物。经接触的NK细胞可以通过包括以下步骤的方法产生：使至少一个NK细胞与至少一种刺激NK的外来体接触，所述至少一种刺激NK的外来体包含存在于外来体膜中的一种或多种刺激肽，其中所述外来体是分泌外来体的细胞的胞外产物。在一些方面，对NK介导的裂解敏感的细胞可能被病毒感染。对NK介导的裂解敏感的细胞可包括恶性细胞，诸如与癌症相关的那些细胞，包括但不限于AML细胞、乳腺细胞、膀胱细胞、结肠和直肠细胞、肾细胞、肺细胞、前列腺细胞、甲状腺细胞和子宫癌细胞。公开了用于降低干细胞移植后复发风险的方法、以及用于辅助治疗方法，所述方法包括施用有效量的包含经接触的NK细胞的组合物，其中经接触的NK细胞是通过包括以下步骤的方法产生的：使至少一个NK细胞与至少一种刺激NK的外来体接触，该外来体包含存在于外来体膜中的一种或多种刺激肽，其中该外来体是分泌外来体的细胞的胞外产物。公开本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于增加NK细胞数目的方法，包括：使至少一个NK细胞与至少一种刺激NK的外来体接触，所述至少一种刺激NK的外来体包括存在于外来体膜中的一种或多种刺激肽，其中所述外来体是分泌外来体的细胞的胞外产物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.27 US 62/069,0571.一种用于增加NK细胞数目的方法，包括：使至少一个NK细胞与至少一种刺激NK的外来体接触，所述至少一种刺激NK的外来体包括存在于外来体膜中的一种或多种刺激肽，其中所述外来体是分泌外来体的细胞的胞外产物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种刺激肽选自由以下项组成的组：4-1BBL、IL-2、IL-12、IL-18、IL-21、MICA/B、ULBP2、ICAM-1、2B4、BCM1/SLAMF2、CD155、CD112、CCR7、DAP12和DAP10。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种刺激肽与膜插入肽偶联。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述膜插入肽包括能够进行膜插入、对脂质双层具有亲和力的融合肽，并且其中所述融合肽包括IG4的区段、CD4的区段、或它们的组合。5.根据权利要求3所述的方法，其中与膜插入肽偶联的所述一种或多种刺激肽是由重组DNA编码的融合蛋白。6.根据权利要求3所述的方法，其中所述膜插入肽包括人Fc、GPI、跨膜T细胞受体或pHLIP。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述NK细胞存在于未选择的外周血单核细胞(PBMC)群体中。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述外来体由经工程化以改善外来体表达的细胞系产生。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述NK细胞在体外、体内或离体地与所述刺激NK的外来体接触。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述NK细胞在体内腹腔中、皮下或在硬膜外腔中的静脉内扩增。11.根据权利要求9所述的方法，其中在同种异体移植手术、单倍体相合移植手术或体内免疫疗法程序中使所述NK细胞与所述刺激NK的外来体接触。12.根据权利要求11所述的方法，其中在同种异体移植、单倍体相合移植或体内免疫疗法中使用刺激NK的外来体不会引起移植物抗宿主病(GVHD)。13.一种用于治疗对NK介导的裂解敏感的细胞的方法，包括施用有效量的包含根据权利要求1所述的方法接触的NK细胞的组合物。14.根据权利要求13所述的方法，其中用病毒感染所述对NK介导的裂解敏感的细胞。15.根据权利要求13所述的方法，其中所述对NK介导的裂解敏感的细胞包括AML细胞、乳腺细胞、膀胱细胞、结肠和直肠细胞、肾细胞、肺细胞、前列腺细胞、甲状腺细胞和子宫癌细胞。16.一种用于降低干细胞移植后的复发风险的方法，包括施用有效量的包含根据权利要求1所述的方法接触的NK细胞的组合物。17.一种用于产生刺激NK细胞的外来体的方法，包括在外来体的膜中包埋一种或多种刺激...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·J·科皮克，J·L·奥耶，R·Y·五十岚，D·阿尔托马尔，
申请(专利权)人：弗罗里达中央大学研究基金会，
类型：发明
国别省市：美国,US