一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法及其应用，该技术方案基于芦笋Y染色体上雌性抑制基因SOFF的CDS序列，开发了4个该基因的功能性STS分子标记。在此基础上，针对4个STS分子标记的自身特点设计了相应的引物和通用的PCR扩增条件，并进一步明确了指向雄性植株的特征条带碱基长度。实验验证发现，本发明专利技术提供的4种分子标记均位于芦笋雌性抑制基因SOFF的编码区，在分子遗传上与雌、雄性别表型共分离，鉴别准确率达到100％，可广泛用于芦笋雌雄性别鉴定以及全雄或全雌品种分子标记辅助选择。此外，实验发现该方法亦可用于兴安天门冬(A.dauricus)、长花天门冬(A.longiflorus)、A.maritumus等天门冬属雌雄异株植物的性别鉴定。

A molecular biology identification method for asparagus dioecious plant sex and its application

The invention provides a method for asparagus sex in dioecious plant molecular biology identification method and its application, the technical scheme of the CDS sequence on Y chromosome in female asparagus inhibited SOFF gene based on functional STS markers developed 4 of the gene. On this basis, the primers and universal PCR amplification conditions were designed according to the characteristics of 4 STS molecular markers, and the characteristic band length of the male plants was further defined. The experimental results showed that 4 kinds of molecular markers provided by the invention are located in female asparagus inhibited SOFF gene encoding region were isolated with female and male don't phenotype in molecular genetic, identification accuracy rate reached 100%, which can be widely used in sex identification and asparagus all male or all female varieties of molecular marker assisted selection. In addition, the experimental results show that this method can also be used in Xingan. (A.dauricus), aspartate (A.longiflorus), long flower sex identification of dioecious plants asparagus A.maritumus.

【技术实现步骤摘要】
一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法及其应用
本专利技术涉及植物分子遗传学
，进一步涉及基于分子标记的植物性别鉴别技术，具体涉及一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法及其应用。
技术介绍
天门冬属(Asparagus)植物约300种，除美洲外，全世界温带至热带地区都有分布；我国有24种和一些外来栽培种，广布于全国各地，除供观赏外，部分种具有食用或药用价值，因此属于农业种植或园艺栽培的植物范畴。其中，芦笋(AsparagusofficinalisL.)，又名石刁柏，为天门冬科天门冬属多年生草本植物，其幼茎质嫩味美，营养丰富，风味独特，是一种深受消费者喜爱的营养保健型高档蔬菜，畅销全球，经济价值高，被誉为“蔬菜之王”。由于天门冬属雌雄异株植物的雌株与雄株之间区别明显，对营养的需求和培养条件也存在一定的差异，因此作为经济作物栽培时可能需要对单一性别的植株进行规模化种植，在这种情况下对天门冬属雌雄异株植物性别的鉴定就显得尤为重要。以芦笋为例，它雌、雄异株，雄株因不结果实消耗养分少，产量比同期生长条件相同的雌株高出25％以上，且寿命长，抗性强，因此，由全部雄株组成的全雄品种目前占全球芦笋种子市场主导地位(陈光宇，2005；Riccardietal.,2011)。与此同时，芦笋雌性植株高大，嫩茎较雄株粗壮，品质更优；芦笋是虫媒授粉，近年来随着我国南方芦笋设施避雨栽培和防虫网的广泛应用，大棚芦笋基本上可做到不结果实，额外消耗养分少，可充分发挥雌株优势，产量更高，品质佳，为此，申请者提出了“全雌栽培”和“全雌育种”概念和设想。芦笋除了花、果实等繁殖器官外，芦笋雄株和雌株在外部形态上没有显著区别，且它从播种到开花大约需要2年时间，故早期难以直接区分雌、雄株。若利用与芦笋性别决定基因紧密连锁的DNA分子标记进行辅助选择，在苗期就能够快速准确区分雌、雄株，将雄株挑选出来集中进行全雄种植，余下雌株集中起来进行全雌种植，同时也有助于芦笋父母本选择、杂交制种，以及两性株全雄育种。前人研究表明，芦笋属于XY型性别决定，其性别是由性染色体上一对等位基因控制，决定雄性的基因相对于决定雌性的基因为显性，雄性为Mm，雌性为mm(Bracaleetal.,1991)。寻找和定位与芦笋性别决定基因连锁的遗传标记，国内外先后有许多研究报道，包括形态标记和生化标记(Maestrietal.,1991)和DNA分子标记(JiangandSink,1997；Jiangetal.,1997；Reamon-Büttneretal.,1998；Reamon-BüttnerandJung,2000；Jamsarietal.,2004；Nakayamaetal.，2006；Gebleretal.，2007；Kazunaetal，2011；Shiobaraetal，2011；Iietal.，2012)。最近Kanno等(2014)将芦笋一个雄性特异RAPD标记T35R54-1600成功转化为一个STS标记MSSTS710，能够鉴定8个芦笋品种雌、雄性别。国内李书粉等(2014)通过AFLP扩增筛选获得与芦笋雄性连锁的AFLP和SCAR标记。Patricia等(2014)利用雄性连锁标记Asp1-T7和EST-SSR背景选择标记成功从西班牙本土‘MoradodeHuétor’两性株后代群体中筛选到四倍体超雄株。显然，前人开发的这些DNA分子标记都不在性别决定基因内部，均不是与性别表型共分离的功能性标记，检测结果存在一定假阳性和误差，且受试验群体限制，不具有通用性。因此，很必要开发与芦笋性别表型共分离的功能性DNA分子标记。除了芦笋，天门属其他雌雄异株植株尚未见性别鉴定DNA分子标记开发研究报道。2010年12月份江西省农科院发起主持由中国、美国、意大利、荷兰等国家参与的芦笋基因组计划国际合作项目《芦笋基因组测序分析》，历时6年研究，成功完成世界上首张芦笋全基因组框架图谱，研究结果即将正式公布，相关数据已释放，可在NCBI参考基因组数据库中查询(Accessions：PRJNA317340、PRJNA259909、PRJNA326431)，这为芦笋遗传学研究、尤其是分子水平上的品种改良奠定了坚实的基础。在此基础上，如果能在DNA层面确定一种区分芦笋雌株、雄株的基因片段，则有可能实现对芦笋性别的精准鉴定。然而，在庞大的基因组中获取决定个体性别的分子标记本身就很困难，再加之某些分子标记虽然与个体性别有关，但往往不独立的决定个体性别、而是与其他基因或环境条件协同发挥作用，因此能与性别特征具有稳定对应关系的分子标记在现有技术中仍未获得。此外，在芦笋性别的分子水平鉴定中，除了分子标记自身的性能之外，引物设计、PCR扩增条件、扩增结果的稳定性及检测精度等都影响着鉴别方法的应用效果。另一方面，如果能以芦笋DNA为基础，根据天门冬属植物基因同源性较高的特点开发一种鉴别雌、雄植株的通用性分子标记及相应的鉴别方法，则有望扩展该方法的适用范围。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法，以解决现有技术中天门冬属雌雄异株植物性别鉴定不准确的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是解决现有技术中除了芦笋外，其他天门冬属雌雄异株植物无性别分子生物学鉴别方法的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是现有技术中芦笋的性别鉴定不准确。本专利技术要解决的再一技术问题是现有技术中基于分子标记的芦笋性别鉴别方法，因分子标记与个体性别之间不具有精准对应关系从而导致检测准确性较低。本专利技术要解决的又一技术问题是当采用本专利技术所披露的分子标记执行芦笋性别鉴定时，缺乏一种高效的PCR引物及PCR扩增条件。本专利技术要解决的又一技术问题是当明确使用上述分子标记、PCR引物及PCR扩增条件的基础上，如何建立一套实际操作方法，从而实现对芦笋雌株、雄株快捷、准确的鉴定。本专利技术要解决的又一技术问题是如何利用本专利技术所提供的芦笋雌、雄株鉴别方法在农业种植中实现单一性别芦笋的规模化栽培。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法，包括以下步骤：1)取待测的天门冬属雌雄异株植物材料，提取单株总DNA；2)以其为模板、利用分子标记的引物执行PCR扩增；3)对扩增产物进行凝胶电泳检测；4)观察电泳结果中是否存在上述分子标记的特征条带。作为优选，所述天门冬属雌雄异株植物是芦笋、兴安天门冬、长花天门冬、A.maritumus。作为优选，所述分子标记位于芦笋雌性抑制基因SOFF的编码区。作为优选，所述分子标记Soff1的正向引物和反向引物序列见附表1；所述特征条带是长度为516bp的条带，序列如SEQIDNO9。作为优选，所述分子标记Soff2的正向引物和反向引物序列见附表1；所述特征条带是长度为777bp的条带，序列如SEQIDNO10。作为优选，所述分子标记Soff4的正向引物和反向引物序列见附表1；所述特征条带是长度为542bp的条带，序列如SEQIDNO11。作为优选，所述分子标记Soff5的正向引物和反向引物序列见附表1；所述特征条带是长度为530bp的条带，序列如SEQIDNO12。作为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：1)取待测的天门冬属雌雄异株植物材料，提取单株总DNA；2)以其为模板、利用分子标记的引物执行PCR扩增；3)对扩增产物进行凝胶电泳检测；4)观察电泳结果中是否存在上述分子标记的特征条带。

【技术特征摘要】
1.一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：1)取待测的天门冬属雌雄异株植物材料，提取单株总DNA；2)以其为模板、利用分子标记的引物执行PCR扩增；3)对扩增产物进行凝胶电泳检测；4)观察电泳结果中是否存在上述分子标记的特征条带。2.根据权利要求1所述的一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法，其特征在于所述天门冬属雌雄异株植物是芦笋、兴安天门冬、长花天门冬或A.maritumus。3.根据权利要求2所述的一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法，其特征在于所述分子标记位于芦笋雌性抑制基因SOFF基因的编码区。4.根据权利要求2所述的一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法，其特征在于所述分子标记的引物其核苷酸序列为:正向引物F：5’-AAACACAGGGCGCTACTGAA-3’；反向引物R：5’-TGTGCGAGTATCCTCCTTGC-3’；所述特征条带的核苷酸序列如SeqIDNo.9所示。5.根据权利要求2所述的一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法，其特征在于所述分子标记的引物其核苷酸序列为:正向引物F：5’-GCGGGCGTAATTTTCCAGTG-3’；反向引物R：5’-GACTTGGGCACAGAAGCAAC-3’；所述特征条带核苷酸序列如SeqIDNo.10所示。6.根据权利要求2所述的一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法，其特征在于所述分子标记的引物其核苷酸序列为:正向引物F：5’-TATCAGGTCGGGGGTAAGCA-3’；反向引物R：5’-TGACTTGGGCACAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：周劲松，陈光宇，罗绍春，汤泳萍，尹玉玲，张岳平，谢启鑫，
申请(专利权)人：江西省农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：江西,36