本发明专利技术提供一种生产B型禽偏肺病毒F蛋白的重组菌株及其应用，本发明专利技术提供的生产B型禽偏肺病毒F蛋白的基因工程毕赤酵母菌，其保藏编号为CCTCC M 2016097。本发明专利技术构建了带有人工设计改造后的B型禽偏肺病毒F蛋白基因的高效表达载体，获得了在毕赤酵母菌中高效表达B型禽偏肺病毒F蛋白的重组菌株，该表达产物为可溶性蛋白。这为工业化生产B型禽偏肺病毒亚单位疫苗奠定了坚实的基础。
【技术实现步骤摘要】
一种生产B型禽偏肺病毒F蛋白的重组菌株
本专利技术属于重组菌株
，具体涉及一种生产B型禽偏肺病毒F蛋白的重组菌 株及其应用。
技术介绍
禽偏肺病毒属于副黏病毒肺病毒属，基因组为不分节段的单股负链RNA，可引起火 鸡发生呼吸道疾病，称为火鸡鼻气管炎;感染鸡后引起病毒性气囊炎，鼻气管炎和肿头综合 征，产蛋下降。20世纪70年代末，禽偏肺病毒引起的疾病首次在南非报道，随后在北美、南 美、中东、远东都有发生。1989年美国首次分离到此病毒。在分离此病毒的同时，往往可分离 到波氏杆菌、巴氏杆菌、假单胞杆菌、鼻气管炎鸟疫杆菌、粪产碱杆菌等。禽偏肺病毒能使气 管纤毛的活动受到抑制，气管中的灰尘向外排出困难，灰尘中所带的大量细菌很容易发生 继发感染，侵害呼吸道。病原禽偏肺病毒可分为三个型:A型感染火鸡，B型感染肉鸡，C型只 在美国存在，A和B两型有交叉保护作用，与C型无交叉保护作用。随着我国禽业养殖规模的 不断扩大，因禽偏肺病毒感染导致的继发感染也日益严重，对养禽业的危害非常严重，唯一 有效办法是通过接种疫苗来预防鸡群的发病。目前国内外对禽偏肺病毒疫苗的研究大多集 中在灭活疫苗的研制。完整的病原体含有许多抗原，但并非所有抗原都能刺激宿主产生保护性应答。其 中某些抗原还能引起过敏，免疫抑制和其他副作用，这是使用完整的病原体做疫苗的缺陷。 并且目前国内应用的灭活苗生产制备抗原过程繁琐，而弱毒疫苗现也有接种疫苗发病情况 存在。而用亚单位疫苗则可以解决这个问题，尤其是这种疫苗除了具有抗原稳定性高，纯度 高，特异性强，敏感性高，不产生其他不相关抗体，免疫效果检测方法方便准确外，还十分易 于生产。不用动物体或是胚体生产，不会带有组织残留物。而且不需灭活，但安全性高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种生产B型禽偏肺病毒F蛋白的重组菌株及其应用，从而为 大规模工业化生产中能生产出高效、安全、价廉的优良亚单位疫苗和诊断试剂服务。 本专利技术提供的生产B型禽偏肺病毒F蛋白的巴斯德毕赤酵母X33_F(Pichia pastoris X33-F)，已于2016年3月9日保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编 号为CCTCC NO:M 2016097。 所述的B型禽偏肺病毒F蛋白，包含有： 1)氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的蛋白， 2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋 白； 编码上述F蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0:2; 本专利技术所提供的基因工程毕赤酵母菌可用于制备疫苗。 本专利技术构建了带有人工设计改造后的B型禽偏肺病毒F蛋白基因的高效表达载体， 获得了在毕赤酵母菌中高效表达B型禽偏肺病毒F蛋白的重组菌株，该表达产物为可溶性蛋 白。这为工业化生产B型禽偏肺病毒亚单位疫苗奠定了坚实的基础。【附图说明】 图1:本专利技术实施例1的F基因 PCR扩增鉴定图； 图2:本专利技术F基因的核苷酸序列比对图； 图3:本专利技术F蛋白的氨基酸序列比对图； 图4:本专利技术实施例高效表达载体的酶切鉴定图； 图5:本专利技术实施例重组菌株X33-F的PCR鉴定图；图6:本专利技术实施例重组菌发酵诱导表达产物的SDS-PAGE电泳检定图。【具体实施方式】 下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细的说明。 实施例1:F蛋白的扩增及序列分析 2010年在山东省多个种鸡场出现了肿头综合症的症状，而发病鸡群之前已经注射 了已有的禽肺病毒疫苗，推测感染的病毒发生了变异；因此从发病个体中进行禽肺病毒的 筛选。最终筛选出了 一株禽肺病毒SHS/A3。 为验证筛选的病毒的抗原性，使用了包含筛选毒株SHS/A3在内的5个不同来源的 病毒株作为抗原制备疫苗，免疫SPF鸡后用SHS/A3株病毒液进行攻毒实验，结果表明相比于 其它禽肺病毒疫苗;其本身制备的疫苗具有更好的免疫效果(P<〇.05);因此确定其发生了 遗传上的变异。 1、扩增B型禽偏肺病毒SHS/A3株(APV)F基因 根据NCBI中发表的F基因序列，设计并合成了引物，引物的序列信息如下： primerl^7 -GGGATGTACCTCAAACTGCTACTAAT-37 ； primer2:5'-TCAACTGATGTAGCCCATGTTGC-3' 〇 2、PCR扩增F基因克隆与序列测定提取SHS/A3株的核酸作为模板，用引物primerl和primer2进行PCR扩增目的片段， 经序列测定（图1为B型禽偏肺病毒F蛋白基因 PCR的扩增鉴定图），结果核苷酸序列为SEQ ID N0:2;其编码的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。与NCBI中已公布的B型禽偏肺病毒的F基因进行 核苷酸序列比对分析，结果同源性在95.1 %~99.2% (图2为SHS/A3株F基因的核苷酸序列 比对图）；推导的氨基酸序列同源性为95.0%~97.4% (图3为SHS/A3株F蛋白的氨基酸序列 比对图）。结果表明，分离的SHS/A3株为新的B型禽偏肺病毒，含有新的F基因。 3、设计并合成B型禽偏肺病毒(APV)F基因根据SHS/A3株F基因的序列测定结果，设计合成一对引物，引物的序列信息如下： primerS^7 -GGGGGTACCATGTACTTGAAGTTGCAATTG-37 ； primer4:5'-GCGGCCGCTCAACTGATGTAACCCATGT-3' 〇以合成的核苷酸序列为SEQ ID N0:2的F基因为模板，用引物primer3和primer4进 行PCR扩增，目的片段产物回收连接pMD18-T载体，转化和筛选阳性克隆pMD18-T-F。 实施例2 :F蛋白的重组表达 I.重组B型禽偏肺病毒F蛋白的制备方法 包括以下步骤:a.构建表达载体;b.构建表达菌株;c.重组F蛋白的诱导和提取纯 化。 a.构建表达载体： 将阳性克隆质粒pMD18-T-F和表达载体pPICZa载体分别用KpnI和NotI双酶切产物 经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶回收试剂盒回收，分别获得约1.6kb和3.3kb片段，在 16°C定向连接构建pPICZa-F表达载体（图4是本专利技术实施例高效表达载体的酶切鉴定图）； 测序验证序列和读码框无误后，将质粒线性化后，电转化入毕赤酵母感受态细胞。 b.构建表达菌株： 电转化后，F基因重组到毕赤酵母基因组中，构建毕赤酵母表达菌株X33-F(已于 2016年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016097;图5); c.重组F蛋白的诱导和提取纯化：[00411诱导表达，挑取含X33-F的单克隆菌落接种于BMGY液体培养基，30°C振荡培养过 夜，离心收集菌体，用适量的BMMY悬浮后，加入终浓度0.5 %甲醇，30°C诱导96小时。4°C， 9000rpm离心5min，保留上清液，加入30 %的硫酸铵沉淀后，12000rpm离心5min收集蛋白沉 淀，用PBS重溶蛋白。加入蛋白电泳上样缓冲液，沸水煮8分钟后，用12%的分离胶进行SDS-PAGE鉴定。（图6中1、2、3为F蛋白表达产物沉淀，M为分子量标准蛋白质。）实施例3:亚单位疫苗的制备 一、亚单位疫苗制备 1.制苗用菌液的制备将X33-F菌种接种于含博莱霉素的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1. 一种基因工程毕赤酵母菌，其特征在于，所述的基因工程毕赤酵母菌的保藏编号为 CCTCC Μ 2016097。2. 权利要求1所述的基因工程毕赤酵母菌在生产Β型禽偏肺病毒F蛋白中的应用。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的Β型禽偏肺病毒F蛋白包含有： 1) 氨基酸序列为SEQ ID ΝΟ:1的蛋白， 2)...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘新文，杜元钊，王秀丽，宋新宇，马爽，李陆梅，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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