分光瞳激光共焦CARS显微光谱测试方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术属于显微光谱成像探测技术领域，涉及一种分光瞳激光共焦CARS显微光谱测试方法及装置。本发明专利技术的核心思想是融合分光瞳激光共焦显微技术与CARS光谱探测技术，采用二向分光系统对瑞利光和CARS光进行无损分离，其中CARS光进行光谱探测，瑞利光进行几何定位。本发明专利技术利用分光瞳激光共焦曲线顶点与焦点位置精确对应这一特性，精确捕获和定位激发光斑焦点位置，实现高精度的几何探测和高空间分辨的光谱探测，构成一种可实现样品微区高空间分辨光谱探测的方法和装置。通过结合CARS显微技术，激发出的载有样品信息的拉曼散射光要远强于传统自发拉曼光，且激发时间短，为快速检测生物样品和化学材料提供可能。本发明专利技术具有定位准确、高空间分辨、光谱探测灵敏度高和测量聚焦光斑尺寸可控等优点，在生物医学，材料检测等领域有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
分光瞳激光共焦CARS显微光谱测试方法及装置
本专利技术属于显微光谱成像
，涉及一种分光瞳激光共焦CARS显微光谱测试方法及装置，可用于快速检测各类样品的微区反斯托克斯散射(CARS)光谱，可实现高空间分辨的几何成像与探测，可获得高空间分辨的“图谱合一”图像。技术背景光学显微镜在生物医学领域和材料科学领域被广泛应用，而随着现代科学的快速发展，对显微成像的要求也从结构成像转向功能成像。1990年，共焦拉曼光谱显微技术的成功应用，极大的提高了探索微小物体具体组织成分及形貌的可能。它将共焦显微技术和拉曼光谱技术相结合，具备共焦显微术的高分辨层析成像特征，又兼有无伤检测和光谱分析能力，已成为一种重要的材料结构测量与分析的技术手段，广泛应用于物理、化学、生物医学、材料科学、石油化工、食品、药物、刑侦等领域。传统的自发拉曼散射成像技术由于拉曼散射本身特性导致其发射信号极弱，即便用高强度的激光激发，要得到一副对比度好的光谱图像，依然需要很长的作用时间。这种长时间作用限制了拉曼显微技术在生物领域的应用。基于相干拉曼效应的相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)过程能够很大程度上增强拉曼信号，从而实现快速检测。相干拉曼效应是通过受激激发的光将分子锁定在振动能级上，这种方法产生的振动信号的强度与激发光的强度成非线性关系，可以产生很强的信号，也称为相干非线性拉曼光谱。它具有很强的能量转换效率，曝光时间短，对样品的损害也比较小，同时它的散射具有一定的方向性，容易与杂散光分离。相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)的产生是一个三阶非线性光学过程，它需要泵浦光、斯托克斯光和探测光。一般而言，为了减少光源的数量，简化过程，常用泵浦光代替探测光，它们之间的关系如图2所示，当泵浦光(wp)和斯托克斯光(ws)的频率之差与拉曼活性分子的振动频率相匹配时，将激发出CARS光was，其中was＝2wp-ws。CARS光的产生过程包含特定的拉曼活性分子的振动模式和导致分子从基态至激发态振动跃迁的入射光场的相互作用过程，它的能级示意图如图3所示。图3(a)表示拉曼共振和非共振单光子增强对CARS过程的贡献，图3(b)表示拉曼共振和非共振双光子增强对CARS过程的贡献；当wp和ws之间的频差与拉曼活性分子的振动频率相匹配时，激发出的信号得到共振增强，同时非共振部分也会由于电子跃迁响应得到增强，因此要得到较好的CARS信号，需要尽可能的抑制非共振背景信号，常见的方法是偏振CARS(P-CARS)方法。P-CARS的原理如图4所示，光源1发出的频率为wp的斯托克斯光，起偏后经过四分之一波片和半波片后与光源2发出的频率为ws的泵浦光(探针光)汇合，经二向分光镜后由反射镜发射至水浸显微物镜，聚焦在样品上，激发出载有光谱特性的CARS光后，透射进入信号采集系统；信号由一个油浸的显微物镜采集，经过一个偏振片过滤非共振背景，然后通过一个滤光片滤除其他谱段的干扰后，被一个雪崩光电二极管所采集，即获得特定频谱的光谱信号。P-CARS能够很大程度的抑制非共振信号和激发光的干扰，但是由于其采用的是两个单波长激光器，只能获得特定频谱的光谱信息，因此它的广泛使用受到了极大的限制。传统CARS显微术没有强调系统的定焦能力，导致实际光谱探测位置往往处于离焦位置。即便光线在离焦位置也能激发出样品的拉曼光谱并被针孔后的光谱仪探测，但是强度并不能合理表征该点正确的光谱信号强度。在CARS显微系统中，只有当系统精确定焦，才能获得最佳空间分辨力和最好的光谱探测能力。上述原因限制了CARS显微系统探测微区光谱的能力，制约了其在更精细微区光谱测试与分析场合中的应用。基于上述情况，本专利技术提出将系统收集到的样品表面散射的强于样品拉曼散射光103～106倍的瑞利光进行高精度探测，使其与光谱探测单元有机融合，进行空间位置信息和光谱信息的同步探测，以实现高空间分辨的、高光谱分辨的分光瞳激光共焦CARS显微图谱成像和探测。本专利技术专利的核心思想是选用超连续谱脉冲激光器和单波长脉冲激光器作为激发光源，扩大激发光谱范围，提高光谱激发强度；将分光瞳激光共焦显微结构与CARS光谱结构结合，利用分光瞳激光共焦响应曲线的“最大值点”与被测样品顶点位置(显微物镜焦点位置)精确对应这一特性，精确定焦，实现高空间分辨；精确定焦后，进行光谱探测，获得最佳光谱分辨能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服现有技术的不足，提出一种具有高空间分辨力的分光瞳激光共焦CARS显微光谱测试方法及其装置。本专利技术是通过以下技术方案实现的。一种分光瞳激光共焦CARS显微光谱测试方法，包括以下步骤：a)在激光发射单元中，由超连续谱激光发出超连续谱激光，经过带通滤光片后通过第一二向色镜与单波长激光器发出的单波长激光耦合，形成混合光束(频率一致，时间一致，空间重合)；混合光束经过照明光瞳以及测量物镜后，会聚在被测样品上，激发出载有被测样品光谱特性的CARS光，同时反射瑞利光；CARS光和瑞利光经测量物镜和收集光瞳后，被第二二向色镜分成两束，其中包含CARS光的光束进入光谱探测单元，另一束包含瑞利光的光束进入分光瞳激光共焦探测单元；在光谱探测单元中，包含CARS光的光束先经过带通滤光片，滤除光束中的非CARS干扰光，然后通过第一会聚镜会聚通过第一针孔，过滤环境光后再由第二会聚镜会聚进入光谱仪，获得CARS光谱信息；在分光瞳激光共焦探测单元中，包含瑞利光的光束经过第三会聚镜后被光强采集系统进行焦斑分割探测，获得分光瞳激光共焦强度信号I(x,y,z)；b)利用分光瞳激光共焦响应曲线“最大值点”与测量显微物镜焦点位置精确对应的特性，通过“最大值点”来精确捕获激发光斑焦点位置后，再测量获得光谱信息I(x,y,λ)，从而实现高空间分辨的几何探测和光谱探测。c)当对接收CARS光的光谱探测单元获得的光谱信号进行处理时，系统能够进行光谱探测(x,y,λ)；当对接收瑞利光的分光瞳激光共焦探测单元获得的分光瞳激光共焦信号进行处理时，系统能够获得三维几何形貌(x,y,z)；当对分光瞳激光共焦信号和CARS信号同时处理时，系统能够进行高空间分辨的微区图谱层析成像(x,y,z,λ)，即实现对被测样品“图谱合一”的分光瞳激光共焦CARS显微光谱高空间分辨成像与探测。特别的，在本专利技术方法中，照明光瞳和收集光瞳可以是圆形、D形或者其他形状。特别的，在本专利技术方法中，激发光束包括线偏光、圆偏光、径向偏振光等偏振光束和由光瞳滤波等技术生成的结构光束，由此提高系统光谱信号信噪比和系统横向分辨率。特别的，在本专利技术方法中，通过匹配不同谱带的滤光片，选择不同谱段的斯托克斯光，可以实现不同谱段的光谱探测；其中，带通滤光片与带通滤光片的滤光谱带关于单波长激光器的中心波长对称。特别的，在本专利技术方法中，激光发射单元还可以用单波长激光器加光子晶体光纤进行光谱展宽实现，此外，将光谱探测单元中的光谱仪替换成光电点探测器，旋转偏振片可以实现光谱扫描输出，进而激发CARS光谱并由光电点探测器探测得到CARS光谱信号；本专利技术提供了一种分光瞳激光共焦CARS显微光谱测试装置，包括激光发射单元、位于激光发射单元出射方向的光谱激发单元、位于光谱激发单元出射方向的二向色单元、位于二向色单元透射方向的光谱探测单元、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分光瞳共焦CARS显微光谱测试方法及装置，其特征在于包括以下步骤：a)在激光发射单元(1)中，由超连续谱激光器(3)发出超连续谱激光，经过带通滤光片(4)后通过第一二向色镜(5)与单波长激光器(2)发出的单波长激光耦合，形成混合光束(频率一致，时间一致，空间重合)；混合光束经过照明光瞳(7)与测量物镜(6)会聚在被测样品(9)上，激发出载有被测样品(9)光谱特性的CARS光，同时反射瑞利光；CARS光和瑞利光经过测量物镜(6)与收集光瞳(8)收集后，通过第二二向色镜(11)后分成两束，其中包含CARS光的光束进入光谱探测单元(17)，另一束包含瑞利光的光束进入共焦探测单元(18)；在光谱探测单元(17)中，包含CARS光的光束先经过带通滤光片(12)，滤除光束中的非CARS干扰光，然后通过第一会聚镜(13)会聚，由第一针孔(14)遮挡环境光，减小环境光干扰后再由第二会聚镜(15)会聚进入光谱仪(16)，获得CARS光谱信息；在分光瞳激光共焦探测单元中，包含瑞利光的光束经过第三会聚镜(19)会聚后，被光强采集系统(20)探测，获得分光瞳激光共焦强度信号I(x,y,z)；b)随着高精度三维平移台(10)的扫描，共焦信号强度随之改变，得到分光瞳激光共焦响应曲线，利用共焦响应曲线“最大值点”与测量显微物镜焦点位置精确对应的特性，通过“最大值点”来精确捕获激发光斑焦点位置后，再测量获得光谱信息I(x,y,λ)，从而实现高空间分辨的几何探测和光谱探测。c)当对接收CARS光的光谱探测单元获得的光谱信号进行处理时，系统能够进行光谱探测(x,y,λ)；当对接收瑞利光的分光瞳激光共焦探测单元获得的分光瞳激光共焦信号进行处理时，系统能够获得三维几何形貌(x,y,z)；当对分光瞳激光共焦信号和CARS信号同时处理时，系统能够进行高空间分辨的微区图谱层析成像(x,y,z,λ)，即实现对被测样品“图谱合一”的激光共焦CARS显微光谱高空间分辨成像与探测。...

【技术特征摘要】
1.一种分光瞳共焦CARS显微光谱测试方法及装置，其特征在于包括以下步骤：a)在激光发射单元(1)中，由超连续谱激光器(3)发出超连续谱激光，经过带通滤光片(4)后通过第一二向色镜(5)与单波长激光器(2)发出的单波长激光耦合，形成混合光束(频率一致，时间一致，空间重合)；混合光束经过照明光瞳(7)与测量物镜(6)会聚在被测样品(9)上，激发出载有被测样品(9)光谱特性的CARS光，同时反射瑞利光；CARS光和瑞利光经过测量物镜(6)与收集光瞳(8)收集后，通过第二二向色镜(11)后分成两束，其中包含CARS光的光束进入光谱探测单元(17)，另一束包含瑞利光的光束进入共焦探测单元(18)；在光谱探测单元(17)中，包含CARS光的光束先经过带通滤光片(12)，滤除光束中的非CARS干扰光，然后通过第一会聚镜(13)会聚，由第一针孔(14)遮挡环境光，减小环境光干扰后再由第二会聚镜(15)会聚进入光谱仪(16)，获得CARS光谱信息；在分光瞳激光共焦探测单元中，包含瑞利光的光束经过第三会聚镜(19)会聚后，被光强采集系统(20)探测，获得分光瞳激光共焦强度信号I(x,y,z)；b)随着高精度三维平移台(10)的扫描，共焦信号强度随之改变，得到分光瞳激光共焦响应曲线，利用共焦响应曲线“最大值点”与测量显微物镜焦点位置精确对应的特性，通过“最大值点”来精确捕获激发光斑焦点位置后，再测量获得光谱信息I(x,y,λ)，从而实现高空间分辨的几何探测和光谱探测。c)当对接收CARS光的光谱探测单元获得的光谱信号进行处理时，系统能够进行光谱探测(x,y,λ)；当对接收瑞利光的分光瞳激光共焦探测单元获得的分光瞳激光共焦信号进行处理时，系统能够获得三维几何形貌(x,y,z)；当对分光瞳激光共焦信号和CARS信号同时处理时，系统能够进行高空间分辨的微区图谱层析成像(x,y,z,λ)，即实现对被测样品“图谱合一”的激光共焦CARS显微光谱高空间分辨成像与探测。2.根据权利1所述的一种分光瞳激光共焦CARS显微光谱测试方法，其特征在于，照明光瞳(7)和收集光瞳(8)可以是圆形、D形或者其他形状。3.根据权利1所述的一种分光瞳激光共焦CARS显微光谱测试方法，其特征在于，激发光束包括线偏光、圆偏光、径向偏振光等偏振光束和由光瞳滤波等技术生成的结构光束，由此提高系统光谱信号信噪比和系统横向分辨率。4.根据权利1所述的一种分光瞳激...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱丽荣，吴寒旭，赵维谦，王允，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：北京,11