一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法技术

本发明专利技术公开了一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法，属于植物诱导再生技术领域。该方法将海南三七根茎芽前处理后，切掉根茎芽上的叶片和茎尖，留芽基部为外植体；将消毒好的外植体接种到诱导培养基上培养，直至外植体基部形成丛生芽；当初代芽基部丛生芽长至4～6cm时，切下芽，截取芽基部1.0‐1.5cm接种到增殖培养基中诱导丛生芽；再切下丛生芽转移至生根培养基上进行生根，当生根培养基上的苗高5～8cm时，在温室自然光照下炼苗7～10d，取出苗，洗净根部培养基，培养后得到移栽苗。本发明专利技术显著提高海南三七的组培繁殖效率。

Method for inducing plant regeneration at base of rhizome and bud of Hainan 37

The invention discloses a method for inducing regeneration of a plant at the base of a 37 rhizome bud of Hainan, belonging to the technical field of plant induced regeneration. The Hainan 37 rhizome bud treatment, cut the rhizome buds on the leaves and stem apex, left basal shoot explants; explant disinfection will be good to the induction medium, until the explants base forming shoots; first generation basal shoot buds grow to 4 ~ 6cm when the cut buds, interception of basal shoot 1 - 1.5cm inoculation to proliferation medium bud induction; cut shoots transferred to the medium for rooting and rooting, rooting medium when the seedling height of 5 ~ 8cm, in the greenhouse under natural light seedling emergence from 7 to 10d,. Wash the root of the culture medium, after transplanting seedlings. The invention remarkably improves the tissue culture propagation efficiency of Hainan 37.

【技术实现步骤摘要】
一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法
本专利技术涉及海南三七，具体涉及一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法，属于植物组织培养快速繁殖

技术介绍
姜科(Zingiberaceae)植物的繁殖方法可通过种子有性繁殖和切分根茎营养繁殖(高江云等，2006)。然而，有些种类是自交不亲和的，有些是多倍体，均不能结种子，只能通过根茎繁殖(高江云等，2006)。切分根茎分株时，不要分得太小，一般不要少于3‐4个，太少会导致生长缓慢或死亡，同时需要带有新生的块茎，新分开的块茎去掉所有茎、叶，以减少水分的丧失(高江云等，2006)。有的属的植物可以通过茎杆扦插来繁殖，如闭鞘姜属、舞花姜属、姜花属、姜属的部分种类，将成熟的茎杆切成带3‐4个节的茎段，直立插入沙土中2节，或茎段平放，用沙土稍微覆盖，保持湿润和遮荫，一段时间后，其节上的芽就会萌蘖形成小植株，稍大后分离栽培(高江云等，2006)。海南三七(Kaempferiarotunda)属于姜科山奈属(Kaempferia)植物，分布于广东、广西、云南、台湾及亚洲南部至东南部(吴德邻等，1981)。其叶丛生，叶片长椭圆形，叶面淡绿色，具暗绿色斑纹，不耐霜冻，冬季地上部分枯死；花先于叶直接从根茎抽出，头状花序具4‐6朵花，花白色，唇瓣较大，紫红色；花期3‐4月；根茎药用有消肿止痛的功效；观叶类，株形好，叶漂亮，花晶莹美丽，在夏秋季节可作为观赏价值高的室内观叶植物(吴德邻等，1981；高江云等，2006；路国辉和王英强，2011；吴德邻等，2016)。由于海南三七不结果，所以不能进行有性繁殖。其也没有茎杆，因此，只能采用上述的切分根茎营养繁殖。因为母本量不足，切分根茎分株繁殖速度有限，而且对母株的损伤也很大，短期内得不到大量植株。现有技术中，采用外植体诱导愈伤组织再分化成苗进行繁殖是可行的方法，但出苗率低，而且周期长。刘盼盼(华南师范大学硕士毕业论文，2013)将海南三七外植体分为假茎段(叶至块根之间的假茎)、叶片、根状茎、芽和茎尖(盆栽和组培苗)，结果盆栽的块茎、假茎段和叶片通过诱导愈伤组织再分化获得无菌苗的途径均失败；组培苗的假茎段和叶片诱导愈伤分化来获得无菌苗，由于愈伤组织增殖及诱导时间较久，并且愈伤至苗的诱导率不足10％，很难快速达到所需的无菌苗株数，故不采用此方法；组培苗的幼芽或茎尖，接种到MS+6‐BA3.0mg/L+2,4‐D1.0mg/L的培养基中，20d左右有愈伤组织产生，30d左右有绒毛状根生成，但也发现，接种到两种培养基MS+6‐BA2.0/3.0mg/L+NAA0.10mg/L上诱导，均只有10％诱导成苗，此种方法愈伤组织分化成苗率低。吴丹(华南师范大学硕士毕业论文，2014)将海南三七无菌苗的三个不同部位(叶片、假茎段和假茎段基部)接种在含有不同浓度的6‐BA和2，4‐D组合的愈伤诱导培养基上，置于黑暗条件下培养，40d后统计愈伤组织诱导情况，发现只有假茎段基部成功诱导出愈伤组织，最佳生长调节剂组合为6‐BA2.0mg/L+2,4‐D1.0mg/L，再接种到愈伤组织分化第一阶段转绿需时30d，再将转绿的愈伤组织块转接入芽分化培养基中，40d左右可逐渐有苗长成，分化率大多集中在42％‐67％之间，此种方法愈伤分化出苗率仍然低，而且从外植体诱导愈伤到分化成苗就需时110d，周期长。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，本专利技术采用根茎芽基部作为外植体，提供了一种海南三七根茎芽基部诱导再生植物的方法，建立了高效的海南三七植株再生体系，显著提高海南三七的组培繁殖效率。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法，其特征在于包括以下步骤：(a)外植体前处理：采集海南三七的根茎用自来水清洗干净，剪掉根茎上的贮藏根和须根后，消毒后晾干；再放入洗净消毒的河沙中，恒温发芽，洗净根茎芽，取其芽基部为外植体材料；(b)丛生芽诱导：将消毒好的外植体接种到诱导培养基上培养，直至外植体基部形成丛生芽；所述的诱导培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤1.0～3.0mg/L、萘乙酸0.01～0.10mg/L、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/L、卡拉胶粉9.5～10.0g/L；(c)增殖继代：当初代芽基部丛生芽长至4～6cm时，切下芽，截取芽基部1.0‐1.5cm接种到增殖培养基中诱导丛生芽；所述增殖继代培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤3.0～8.0mg/L、萘乙酸0.05～0.10mg/L、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/L、卡拉胶粉9.5～10.0g/L；(d)生根培养：当继代苗高4～7cm时，切下接种到生根培养基中，所述生根培养基成分为MS、萘乙酸0.10～0.50mg/L、香蕉泥10.0～15.0％、活性炭1.0～1.5g/L、蔗糖20～30g/L、卡拉胶粉9.5～10.0g/L；(e)炼苗移栽：当生根培养基上的苗高5～8cm时，在温室自然光照下炼苗7～10d，取出瓶苗，洗净根部培养基，百菌清溶液消毒后，移栽到进口泥炭的基质中，保持通风透气，湿度在70～85％，温度在20～32℃，自然光照条件培养后得移栽苗。为了进一步实现本专利技术目的，优选地，步骤(a)所述的根茎芽的芽高为6‐18cm，有1片叶。优选地，步骤(a)所述的消毒后晾干的消毒是将海南三七的根茎放入质量浓度0.1‐0.3％的多菌灵粉剂溶液中浸泡消毒30‐40min。优选地，步骤(a)所述的恒温发芽是在培养箱中33℃恒温发芽下进行。优选地，步骤(a)所述的外植体为切掉海南三七根茎芽上的叶片和茎尖后留下的1～2cm的芽基部。优选地，以质量百分比浓度计，步骤b)所述外植体的消毒是先用0.1％‐0.3％高锰酸钾溶液浸泡根茎芽30～40min，再用0.1％～0.3％的百菌清溶液，浸泡根茎芽30～40min，接着在自来水下反复冲洗根茎芽30～40min；晾干表面水分后，在超净工作台上，切掉根茎芽上的叶片和茎尖，留2～3cm高的根茎芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭芽基部，最后用0.1～0.2％升汞溶液消毒15‐18min，灭菌水冲洗4～5次，切掉距离芽基部两头各约0.3～0.5cm的部分，留1～2cm的芽基部，并将芽基部接种到诱导培养基中。优选地，步骤(e)中如果温度高于32℃，用风机和水帘降温。优选地，所述诱导培养基、增殖继代培养基和生根培养基的pH都为5.6～5.8；培养基灭菌条件为125℃，30～40min。优选地，步骤(b)、步骤(c)和步骤(d)所述培养的温度为25～30℃，光照强度为2000～2300lx，光照时间控制为14h/d。优选地，步骤(e)所述百菌清溶液消毒是用0.1％～0.3％的百菌清溶液浸泡30～40min。应用本专利技术的外植体消毒方法，消毒成活率可达到85～90％，15～20d能在外植体上观察到肉眼可见的绿点。相对于现有技术，本专利技术的优点和有益效果为：(1)本专利技术采用海南三七根茎芽基部为外植体，建立了高效的以芽繁芽途径的植株再生体系，外植体初代培养60～65d，启动率87.50％～98.50％，出芽指数2.15～4.60，外植体大部分可以分化出2‐5个丛生芽，长势较好；继代增殖经约20～25d培养，单个丛生芽基部可分化出4～9个丛本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法，其特征在于包括以下步骤：(a)外植体前处理：采集海南三七的根茎用自来水清洗干净，剪掉根茎上的贮藏根和须根后，消毒后晾干；再放入洗净消毒的河沙中，恒温发芽，洗净根茎芽，取其芽基部为外植体材料；(b)丛生芽诱导：将消毒好的外植体接种到诱导培养基上培养，直至外植体基部形成丛生芽；所述的诱导培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤1.0～3.0mg/L、萘乙酸0.01～0.10mg/L、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/L、卡拉胶粉9.5～10.0g/L；(c)增殖继代：当初代芽基部丛生芽长至4～6cm时，切下芽，截取芽基部1.0‐1.5cm接种到增殖培养基中诱导丛生芽；所述增殖继代培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤3.0～8.0mg/L、萘乙酸0.05～0.10mg/L、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/L、卡拉胶粉9.5～10.0g/L；(d)生根培养：当继代苗高4～7cm时，切下接种到生根培养基中，所述生根培养基成分为MS、萘乙酸0.10～0.50mg/L、香蕉泥10.0～15.0％、活性炭1.0～1.5g/L、蔗糖20～30g/L、卡拉胶粉9.5～10.0g/L；(e)炼苗移栽：当生根培养基上的苗高5～8cm时，在温室自然光照下炼苗7～10d，取出瓶苗，洗净根部培养基，百菌清溶液消毒后，移栽到进口泥炭的基质中，保持通风透气，湿度在70～85％，温度在20～32℃，自然光照条件培养后得移栽苗。...

【技术特征摘要】
1.一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法，其特征在于包括以下步骤：(a)外植体前处理：采集海南三七的根茎用自来水清洗干净，剪掉根茎上的贮藏根和须根后，消毒后晾干；再放入洗净消毒的河沙中，恒温发芽，洗净根茎芽，取其芽基部为外植体材料；(b)丛生芽诱导：将消毒好的外植体接种到诱导培养基上培养，直至外植体基部形成丛生芽；所述的诱导培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤1.0～3.0mg/L、萘乙酸0.01～0.10mg/L、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/L、卡拉胶粉9.5～10.0g/L；(c)增殖继代：当初代芽基部丛生芽长至4～6cm时，切下芽，截取芽基部1.0‐1.5cm接种到增殖培养基中诱导丛生芽；所述增殖继代培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤3.0～8.0mg/L、萘乙酸0.05～0.10mg/L、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/L、卡拉胶粉9.5～10.0g/L；(d)生根培养：当继代苗高4～7cm时，切下接种到生根培养基中，所述生根培养基成分为MS、萘乙酸0.10～0.50mg/L、香蕉泥10.0～15.0％、活性炭1.0～1.5g/L、蔗糖20～30g/L、卡拉胶粉9.5～10.0g/L；(e)炼苗移栽：当生根培养基上的苗高5～8cm时，在温室自然光照下炼苗7～10d，取出瓶苗，洗净根部培养基，百菌清溶液消毒后，移栽到进口泥炭的基质中，保持通风透气，湿度在70～85％，温度在20～32℃，自然光照条件培养后得移栽苗。2.根据权利要求1所述的海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法，其特征在于，步骤(a)所述的根茎芽的芽高为6‐18cm，有1片叶。3.根据权利要求1所述的海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法，其特征在于，步骤(a)所述的消毒后晾干的消毒是将海南三七的根茎放入质量浓度0.1‐0.3％的多菌灵粉剂溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：李冬梅，刘小飞，
申请(专利权)人：广东省农业科学院环境园艺研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44