一个芝麻花药特异表达启动子PSicwinv1及其应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及一个芝麻花药特异表达启动子PSicwinv1及其应用。本发明专利技术分离的启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。对该启动子进行生物功能验证，GUS染色检测表明，本发明专利技术克隆的特异启动子PSicwinv1驱动报告基因在拟南芥的根、茎、叶和荚果中均不表达，只在花药中特异表达，并且其表达量与花药的发育时期有关。原位杂交表明Sicwinv1在芝麻花药发育的四分体时期高量表达，且主要在绒毡层和四分体中表达。本发明专利技术公开了该启动子PSicwinv1为花药特异表达启动子，能用于芝麻雄性不育基因工程的研究以及杂种优势利用。

A sesame anther specific expression promoter PSicwinv1 and uses thereof

The invention belongs to the field of plant gene engineering technology, in particular to a sesame anther specific expression promoter PSicwinv1 and the application thereof. The nucleotide sequence of the invention separates the promoter sequence as shown in listing SEQ ID NO:1. The biological function of verification of the promoter, GUS staining assay showed that the cloned specific PSicwinv1 promoter driven reporter gene was not expressed in Arabidopsis roots, stems, leaves and pods, only in anther specific expression, and the expression quantity and the anther developmental stages. In situ hybridization showed that Sicwinv1 was expressed in four stages of anther development in sesame, and expressed mainly in tapetum and four body. The invention discloses that the promoter PSicwinv1 is an anther specific expression promoter, which can be used for the study of genetic engineering of male sterility in sesame and the utilization of hybrid vigor.

【技术实现步骤摘要】
一个芝麻花药特异表达启动子PSicwinv1及其应用
本专利技术属于植物基因工程
具体涉及一个芝麻花药特异表达启动子PSicwinv1及其应用。从芝麻中分离、鉴定得到一个特异表达的Sicwinv1基因的启动子，将其命名为PSicwinv1。该启动子只在花药中特异表达，在其他组织中均无表达。本专利技术克隆的启动子可在芝麻或其他植物花药发育和雄性不育基因工程以及品种改良中应用。
技术介绍
启动子是位于基因5’端上游、指导RNA聚合酶和转录因子特异结合，进而启动基因特异表达的一段特定DNA序列，是调控基因表达的重要顺式作用元件。启动子在植物基因工程中发挥着重要作用，是基因工程表达载体的重要组成元件，调控着外源基因的转录效率和时空表达模式。按照启动子的调控表达模式，可将启动子分为组成型启动子和特异型启动子。组成型启动子驱动外源基因在各个组织和发育阶段高效表达，不具有时空特异性。典型的应用于植物基因工程的组成型启动子有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、水稻肌动蛋白Act启动子及玉米泛素Ubi启动子(关丽英等，转基因植物中外源基因的有效表达及其安全评价.首都师范大学学报，2002，23(2)：52-56)。但是，组成型启动子的高效、非特异表达易造成细胞物质过度消耗，且目标基因不能受到特定的时空调控表达，导致一些负面效应产生。因而，特异型启动子近年来受到了越来越多的关注。特异型启动子包括组织特异型启动子和诱导型启动子。组织特异型启动子驱动目标基因在特定的组织或器官中表达，通常伴随有发育调节的特性。该类启动子一般存在一些与组织特异性相关的特异基序(贺红霞等，组织特异性启动子在作物基因工程中的研究进展.中国农学通报，2014，30(9)：225-231)。组织特异型启动子有效的避免了资源浪费及细胞毒害等负面效应，在转基因育种中具有重要的应用价值。近年来，一些组织特异型启动子被相继分离和鉴定，如绿色组织特异启动子、果实及种子特异启动子、根特异启动子、维管束特异启动子及花器官特异启动子，并应用到相关性状的遗传改良(Potenzaetal.,2004,Targetingtransgeneexpressioninresearch,agricultural,andenvironmentalapplications:Promotersusedinplanttransformation.InVitroCellDevBiolPlant,40:1-22)。利用花药或花粉特异表达启动子创制雄性不育系应用于杂交育种已取得了一定的进展。利用烟草花药绒毡层特异表达的启动子PTA29融合淀粉芽孢杆菌的核糖核酸水解酶基因barnase构建的载体遗传转化受体植株，创制了雄性不育系(Marianietal.,1990,Inductionofmalesterilityinplantsbyachimaericribonucleasegene.Nature,347:737-741)。水稻RTS基因在减数分裂的花药绒毡层中表达，利用该基因的启动子融合barnase或者RTS的反义链并转化水稻、拟南芥均导致转基因植株雄性不育(Luoetal.,2006,RTS,ariceanther-specificgeneisrequiredformalefertilityanditspromotersequencedirectstissue-specificgeneexpressionindifferentplantspecies.PlantMolBiol,62:397-408)。芝麻具有较强的杂种优势，雄性不育是作物杂种优势利用的重要途径，利用雄性不育系创制杂交种对于芝麻遗传改良具有重要的意义。因而，挖掘芝麻花药特异表达启动子对于芝麻雄性不育相关基因功能验证和雄性不育系创制具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一个从芝麻中分离克隆的花药特异表达启动子。本专利技术的启动子属于一种内源启动子，通过RT-PCR检测表明该启动子驱动的内源基因只在花药中表达，在其他组织中均无表达。通过检测报告基因GUS的表达特征表明启动子驱动的基因只在花药中表达，并且其表达量与花药的发育时期有关。原位杂交表明该启动子驱动的内源基因在芝麻花药发育的四分体时期表达量最高。本专利技术不仅丰富了芝麻花药特异表达启动子资源，同时预示着该启动子在雄性不育研究中具有相当广阔的应用前景。将该启动子运用于雄性不育相关基因的功能验证以及雄性不育系的创制，为杂种优势利用提供技术基础和遗传资源。实现本专利技术目的的的技术方案如下所述：为了获得本专利技术，专利技术人比较了芝麻隐性细胞核雄性不育系95ms-5的可育株和不育株四分体时期花药转录组，从芝麻中分离得到一个显著差异表达的基因Sicwinv1，对该基因的组织表达分析验证表明，该基因只在芝麻的花药中特异表达，在根、茎、叶、花瓣、雌蕊、柱头中均不表达(图1)。通过PCR扩增得到该基因的启动子PSicwinv1，其核苷酸序列如序列表SEQNO:1所示。本专利技术的启动子来源于芝麻，由1205个碱基组成。通过构建由该启动子调控的报告基因GUS的植物表达载体PCAMBIA1381Xb-ProSicwinv1(图2中的B图)，并将该转化载体转化到哥伦比亚生态型拟南芥中，得到该启动子的转基因阳性拟南芥植株。通过GUS染色分析发现，该启动子只驱动GUS基因在花药中表达，在根、茎、叶、荚果、花瓣中均检测不到GUS基因的表达(图3)。并且在花药的不同发育时期，PSicwinv1驱动报告基因GUS的表达存在差异(图4)。通过原位杂交分析表明，PSicwinv1驱动内源基因在芝麻花药的四分体时期高量表达，并且主要在绒毡层和四分体中表达(图5)。这些研究表明，PSicwinv1是一个花药特异表达启动子，能够应用于植物雄性不育基因工程和植物杂种优势利用以及品种改良中。本专利技术的具体操作步骤如下：(1)根据芝麻基因组序列设计Sicwinv1基因的启动子扩增引物，以申请人前期工作获得的芝麻隐性细胞核雄性不育系95ms-5(Zhaoetal.,2013,Characterizationandgeneticmappingofanovelrecessivegenicmalesterilegeneinsesame(SesamumindicumL.).MolBreeding,32:901-908)的DNA为模板，扩增启动子序列，该启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。用于扩增Sicwinv1基因的引物序列如下：PSicwinv1-F：5'-CCATATCATTTTCTGGCCTTTC-3'PSicwinv1-R：5'-GGTTGAGGAAAACCTCATGG-3'PSicwinv1-MF：5'-GAGAATTC(EcoRI)CTGGCCTTTCTATTAATTGA-3'PSicwinv1-MR：5'-GCAAGCTT(HindIII)CTCCAAGATTGAGACTACAC-3'(2)将步骤1)扩增所获得的DNA片段以及PCAMBIA1381Xb质粒(图2A)，进行酶切连接反应，将该启动子连接到载体PCAMBIA1381Xb上，再通过热激转化大肠杆菌感受态细胞TOP10中，获得含有该启动子的重组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离自芝麻的特异表达的启动子PSicwinv1，该启动子只在花药中特异表达，不在其他组织中表达，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种分离自芝麻的特异表达的启动子PSicwinv1，该启动子只在花药中特异表达，不在其他组织中表达，该启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.权利要求1所述的一种分离自芝麻的特异表达的启动子PSicwinv1...

【专利技术属性】
技术研发人员：周婷，赵应忠，郝国存，刘红艳，杨敏敏，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42