一种高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株及构建方法技术

本发明专利技术公开了一种高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株及构建方法，属于工业微生物技术领域。以酿酒酵母NJZCC17和NJZSC5作为出发菌株，进行单倍体分离，通过分别敲除单倍体的ALD6基因，得到基因改良菌株，将基因改良后的17A24‑ald6△(MATa)菌株和5125‑ald6△(MATα)菌株进行二倍体杂交融合，得到二倍体杂交菌株NJZ17A5‑ald6△。该酿酒酵母在酒精发酵过程中乙酸产量降低，而碳代谢流更多地转向生成并积累甘油；乙酸乙酯的产量降低；异戊醇和2‑苯乙醇产量分别提高。因此，为葡萄酒酿造工业提供了一种降低乙酸产量的同时又能提高甘油产量的新方法。

Saccharomyces cerevisiae strain for producing high yield glycerin and low acetic acid and method for constructing the same

The invention discloses a Saccharomyces cerevisiae strain for producing high yield glycerin and low yield acetic acid and a construction method thereof, belonging to the technical field of industrial microorganisms. In Saccharomyces cerevisiae NJZCC17 and NJZSC5 as the starting strain, haploid separation by ALD6 gene knockout haploid, are genetically modified strains, the gene modified 17A24 Delta ALD6 (MATa) strains and 5125 Delta ALD6 (MAT alpha) were diploid hybrid fusion from diploid hybrid strain NJZ17A5 Delta ald6. Reduce the acetic acid in Saccharomyces cerevisiae during alcoholic fermentation yield, while the carbon metabolic flow more to generate and accumulate glycerol; reduce the yield of ethyl acetate; isoamyl alcohol and benzene ethanol production increased 2. Therefore, a new method for reducing the yield of acetic acid and increasing the yield of glycerol is provided for the wine making industry.

【技术实现步骤摘要】
一种高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株及构建方法
本专利技术属于工业微生物
，具体涉及一种高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株及构建方法。
技术介绍
随着我国综合国力和人民生活水平的显著提高，葡萄酒消费额度逐年上升，市场逐年扩大。正常情况下，葡萄酒中的挥发酸在0.4～0.6g/L之间，不应超过1.1g/L。其含量的变化可以看作葡萄酒酿造和储藏健康状况的“晴雨表”。过高的挥发酸含量会严重影响葡萄酒的感官品质，使葡萄酒在品尝时产生令人不愉快的灼热感和呛人的刺激气味，嗅闻时会产生刺鼻的酸味，掩盖葡萄酒的其他香气。葡萄酒中主要的挥发性有机酸是乙酸，可以占到总挥发酸的80～90％以上。因此控制乙酸的产量便可以很好的控制总挥发酸量。甘油是酿酒酵母产生的对葡萄酒感官特性影响最大的副产物。甘油不仅可以赋予葡萄酒淡淡的甜味，而且赋予葡萄酒柔润、醇厚和如履丝绒的口感，对酒体的典型性也起到重要作用。甘油在葡萄酒中的含量为3～9g/L，其含量的多少在葡萄原料相同的前提下取决于所采用的酿造技术和酿酒酵母菌株。在酿酒酵母中，乙酸是由丙酮酸脱氢酶支路(PDH)的关键酶乙醛脱氢酶系(ACDH)产生的。丙酮酸脱氢酶支路在丙酮酸脱羧酶(PDC)、乙醛脱氢酶系(ACDH)和乙酰辅酶A合成酶等酶的作用下经过一系列反应将丙酮酸转化为乙酰辅酶A。ACDH可将PDH中间产物乙醛氧化为乙酸。Ald6p是ACDH酶系中主要的细胞浆质乙醛脱氢酶，其由ALD6基因编码，也是乙酸产生的关键酶；其同工酶Ald4p为主要的线粒体乙醛脱氢酶，在ALD6基因缺失时，由ALD4基因编码并补偿由于ALD6缺失造成的代谢失衡。在葡萄酒酿造工业筛选乙酸产量低而甘油产量高的酿酒酵母菌株是广大科研工作者的主要兴趣所在。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在解决由于酿酒酵母在葡萄酒酒精发酵过程中乙酸含量过高而甘油含量偏低的问题，而提供了一种基因敲除的高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株及构建方法。本专利技术的第一方面，提供一种高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株的构建方法，按照以下步骤进行：1)、以酿酒酵母NJZCC17(专利保藏号：CGMCC3284)和NJZSC5(专利保藏号：CGMCCNo.3732)作为出发菌株，进行单倍体分离，筛选得到两株单倍体菌株，分别命名为17A24(MATa)单倍体酿酒酵母和5125(MATα)单倍体酿酒酵母；2)、采用基因敲除技术，利用pUG6质粒对17A24(MATa)单倍体酿酒酵母和5125(MATα)单倍体酿酒酵母的ALD6基因分别进行敲除；再利用pSH65质粒对两端带有loxP位点的G418抗性基因KanMX分别进行敲除；得到基因改良菌株17A24-ald6△(MATa)和5125-ald6△(MATα)；3)、将野生型17A24(MATa)单倍体酿酒酵母和野生型5125(MATα)单倍体酿酒酵母，及基因改良后的17A24-ald6△(MATa)菌株和5125-ald6△(MATα)菌株进行二倍体杂交融合，最后得到NJZ17A5和NJZ17A5-ald6△两株新的二倍体杂交菌株。进一步地，上述步骤2)所述ALD6基因敲除是采用pUG6质粒对ALD6基因进行敲除，所设计的敲除质粒的引物为：上游引物：5'-AACATCAAGAAACATCTTTAACATACACAAACACATCTTCGTACGCTGCAGGTC-3'；下游引物：5'-TTTGTGTATATGACGGAAAGAAATGCAGGTTGGTACATTAGCATAGGCCACTAGTGGATCTG-3'；PCR扩增条件为：94℃×4min，一个循环；94℃×30s,62℃×30s，72℃×1min，30个循环；72℃×10min，一个循环；PCR扩增体系(50μL)的组成为：模板DNA1μL，10×PCR反应缓冲液(Mg2+plus)5.0μL，10μM引物(上下游)各1μL，10mMdNTPs4μL，TaqDNA聚合酶5U/μL，ddH2O37.75μl，混匀。本专利技术的第二方面，提供一种由上述方法构建的高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株。在本专利技术的一个实施例中，对二倍体杂交菌株NJZ17A5-ald6△的乙酸、甘油、乙醛及其他主要酿造特性与初始菌株NJZCC17和NJZSC5进行了比较发酵研究，发现ALD6敲除菌株的甘油产量提高了近30％，而乙酸和挥发酸的量减少了近50％，对葡萄酒风味有不利影响的乙醛和乙酸乙酯含量降低了近50％和60％，而对葡萄酒(尤其是白葡萄酒)风味有利的物质异戊醇和2-苯乙醇产量分别提高了16％左右。本专利技术的第三方面，提供该高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株在葡萄酒发酵中降低乙酸产量且提高甘油产量的应用。本专利技术的第四方面，提供该高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株在葡萄酒发酵中提高异戊醇和2-苯乙醇的产量并降低挥发性物质的产量的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：本申请以酿酒酵母NJZCC17(专利保藏号：CGMCCNo.3284)和NJZSC5(专利保藏号：CGMCCNo.3732)作为出发菌株，获得的基因敲除杂交酿酒酵母NJZ17A5-ald6△(MATa/MATα)，在酒精发酵过程中生成乙醛从而转化为乙酸的能力降低，因此乙酸产量降低，而碳代谢流更多地转向生成并积累甘油。由于乙酸含量的降低，因此导致乙酸乙酯含量的降低。而由于碳氮代谢流的转变下，这些物质的代谢和积累也发生了改变。而对葡萄酒(尤其是白葡萄酒)风味有利的物质异戊醇和2-苯乙醇产量分别提高。杂交酿酒酵母NJZ17A5-ald6△(MATa/MATα)除了上述优点之外，还保留了两株亲本株本来的优点，比如起酵速度快、H2S产量低、发酵过程中产生泡沫少、糖和酒精耐受度高、不产生有机胺、发酵结束后残糖低等。因此，为葡萄酒酿造工业提供了一种降低乙酸产量的同时又能提高甘油产量的新方法。附图说明图1为酿酒酵母NJZSC5诱导生孢显微照片；图2为酿酒酵母NJZCC17诱导生孢显微照片；图3为酿酒酵母单倍体5125显微照片；图4为酿酒酵母单倍体17A11显微照片；图5为pUG6的质粒图谱；图6为ALD6线性敲除质粒(1753bp)电泳图谱：左边为线性敲除质粒，中间为阴性对照，右边为D2000Marker；图7为pSH65的质粒图谱；图8为17A24-ald6△(MATa)和5125-ald6△(MATα)杂交融合后再次诱导生孢的显微照片；图9为17A24(MATa)和5125(MATα)杂交融合后再次诱导生孢的显微照片；图10为NJZ17A5-ald6△、NJZ17A5、NJZCC17及NJZSC5在发酵条件下CO2失重比较。具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。所提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的半合成发酵培养基配方如下：葡萄糖，200g/1000mL；酵母抽提物，10g/1000mL；硫酸铵，1g/1000mL；磷酸钾，1g/1000mL；硫酸镁，1g/1000mL；121℃，灭菌15min后用浓度为10g/1000mL的无菌柠檬酸溶液调本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，按照以下步骤进行：1)、以酿酒酵母NJZCC17(专利保藏号：CGMCC No.3284)和NJZSC5(专利保藏号：CGMCC No.3732)作为出发菌株，进行单倍体分离，筛选得到两株单倍体菌株，分别命名为17A24(MATa)单倍体酿酒酵母和5125(MATα)单倍体酿酒酵母；2)、采用基因敲除技术，利用pUG6质粒对17A24(MATa)单倍体酿酒酵母和5125(MATα)单倍体酿酒酵母的ALD6基因分别进行敲除；再利用pSH65质粒对两端带有loxP位点的G418抗性基因KanMX分别进行敲除；得到基因改良菌株17A24‑ald6△(MATa)和5125‑ald6△(MATα)；3)、将基因改良后的17A24‑ald6△(MATa)菌株和5125‑ald6△(MATα)菌株进行二倍体杂交融合，最后得到新的二倍体杂交菌株NJZ17A5‑ald6△。

【技术特征摘要】
1.一种高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，按照以下步骤进行：1)、以酿酒酵母NJZCC17(专利保藏号：CGMCCNo.3284)和NJZSC5(专利保藏号：CGMCCNo.3732)作为出发菌株，进行单倍体分离，筛选得到两株单倍体菌株，分别命名为17A24(MATa)单倍体酿酒酵母和5125(MATα)单倍体酿酒酵母；2)、采用基因敲除技术，利用pUG6质粒对17A24(MATa)单倍体酿酒酵母和5125(MATα)单倍体酿酒酵母的ALD6基因分别进行敲除；再利用pSH65质粒对两端带有loxP位点的G418抗性基因KanMX分别进行敲除；得到基因改良菌株17A24-ald6△(MATa)和5125-ald6△(MATα)；3)、将基因改良后的17A24-ald6△(MATa)菌株和5125-ald6△(MATα)菌株进行二倍体杂交融合，最后得到新的二倍体杂交菌株NJZ17A5-ald6△。2.根据权利要求1所述的高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，步骤2)所述ALD6基因敲除是采用pUG6质粒对ALD6基因进行敲除，所设...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁恒宇，徐农，王凯，李遥力，
申请(专利权)人：梁恒宇，武汉生物技术研究院，
类型：发明
国别省市：湖北,42