猪胎儿成纤维细胞冻存液制造技术

本发明专利技术属于细胞保存技术领域，具体涉及一种猪胎儿成纤维细胞冻存液。该猪胎儿成纤维细胞冻存液包括以下组分：蔗糖、乙二醇、二甲基亚砜和DMEM基础培养基。本发明专利技术的细胞冻存液质量稳定，能够很好的解决由于血清品质差异导致的冻存效果不稳定难题。该细胞冻存液能够很好的缓解冻存过程中冰晶对细胞的伤害，复苏后的细胞活力达90％，电转后细胞形态和增殖活力良好，且该细胞冻存液成本低。

Porcine fetal fibroblast cell cryopreservation

The invention belongs to the technical field of cell preservation, in particular to a porcine fetal fibroblast cell freeze up liquid. The porcine fetal fibroblast cryopreservation solution consisted of the following components: sucrose, ethylene glycol, two methyl sulfoxide and DMEM basal medium. The invention has the advantages of stable quality of the cell cryopreservation liquid and good solution to the unstable storage effect caused by the difference of serum quality. The cell cryopreservation solution can alleviate the damage of ice crystal to the cell during cryopreservation, and the cell viability after resuscitation is 90%. The cell morphology and proliferation are good after the electroporation, and the cryopreservation cost of the cell is low.

【技术实现步骤摘要】
猪胎儿成纤维细胞冻存液
本专利技术属于细胞保存
，具体涉及一种猪胎儿成纤维细胞冻存液。
技术介绍
猪的器官大小、生理、代谢、寿命及疾病发生机理等都与人有较大的相似性，相对于非人类灵长类动物而言，猪没有苛刻的伦理道德和动物保护方面的要求，加上繁殖力高，饲养成本低，猪已成为人类疾病研究的理想动物模型。许多疾病难以通过自发或人工定向培育的方法获得疾病研究的相关动物模型。基因编辑技术的出现，为人类精确地研究基因与疾病的相关关系提供了可能。目前，猪的胚胎干细胞一直没有建立相应的干细胞数据库，也没有国际公认的诱导性多能干细胞(IPS)用于基因操作，目前制备基因修饰猪应用最广泛的是猪胎儿成纤维细胞。正常的猪胎儿成纤维细胞在体外培养时会不停生长分裂从而导致最终衰老和凋亡。为了保护及合理有效利用细胞资源，人们需要将细胞种子资源保存起来以供日后使用。目前，猪胎儿成纤维细胞保存普遍采用低温冷冻。低温冻存需要添加冷冻保护剂，如果直接冷冻，细胞内会产生冰晶对细胞造成伤害，从而导致细胞死亡。血清能稳定细胞膜、缓冲和保护细胞，调整细胞内渗透压，减少在冻存和长期储存过程中的活性氧自由基对细胞造成伤害，是猪胎儿成纤维细胞冻存常用的保护剂，使用血清来冻存，细胞存活率高，效果好。但血清价格昂贵，且不同来源血清所含促细胞因子、促贴附因子、激素以及其他活性物质等组份与比例不同，市场上销售的血清鱼龙混杂，不同品牌血清质量差异大，即使是同一品牌，也存在不同批次之间的差异。因此猪胎儿成纤维细胞冻存液中血清的质量常常制约着复苏后细胞的活力与增殖能力，尤其是在制备基因修饰猪过程中，复苏后的细胞必须具有稳定的增殖活力，才能经受后期的转染与筛选。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种猪胎儿成纤维细胞细胞冻存液。除特殊说明外，所述百分比均为体积百分比。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：一种猪胎儿成纤维细胞冻存液，包括以下组分：蔗糖、乙二醇、二甲基亚砜和DMEM基础培养基。所述DMEM的英文全称为dulbecco'smodifiedeaglemedium，中文译名为改良杜氏伊格尔培养基，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量。专利技术人意外发现，将以上冻存液用于猪胎儿成纤维细胞冻存，能够在细胞冷冻的初始阶段使细胞脱水，从而减少冷冻降温过程中胞内冰晶形成从而保护细胞不受冷冻损害。进一步，所述蔗糖的终浓度为0.1-0.5mol/L。进一步，所述乙二醇的体积分数为15-25％，二甲基亚砜的体积分数为15-25％，DMEM基础培养基的体积分数为50-70％。专利技术人意外发现，按照上述比例配比，冻存液能够穿过猪胎儿成纤维下拨的细胞膜渗透到细胞内，增大胞内渗透压，降低冰点，延缓冻存过程。在依据本专利技术的冻存液中，本领域技术人员还可根据具体的使用要求，在本专利技术的冻存液中添加白蛋白、海藻糖、丙二醇、糖酐、维生素C、脯氨酸等冷冻保护剂。上述白蛋白、海藻糖、丙二醇、糖酐、维生素C、脯氨酸等冷冻保护剂于本领域普通技术人员而言是清楚的概念。本专利技术的目的之二在于保护所述冻存液的制备方法，包括以下步骤：取蔗糖浓储、乙二醇、二甲基亚砜以及适量DMEM基础培养基，配制成冻存液；其中，蔗糖浓储配制方法为：称取蔗糖，溶于DMEM基础培养基，过滤，分装，于-20℃保存。进一步，所述冻存液包括以下步骤：取0.2-1体积份蔗糖浓储、1.5-2.5体积份乙二醇、1.5-2.5体积份二甲基亚砜以及适量DMEM基础培养基，配制成总体积为10体积份的冻存液；其中，蔗糖浓储配制方法为：称取蔗糖，溶于10体积份DMEM基础培养基，用0.22um过滤器过滤，分装，于-20℃保存。本专利技术的目的还在于保护一种猪胎儿成纤维细胞的保存方法，包括以下步骤：向猪胎儿成纤维细胞中加入所述冻存液，混匀后冻存。进一步，所述冻存液的用量为每mL冻存液中细胞浓度为1×106-5×106个。进一步，所述冻存具体为置于程序降温盒内于-80℃条件下保存。待猪胎儿成纤维细胞生长至85-90％融合时，用0.05-0.25％的胰酶消化液消化细胞。取少量细胞用血细胞计数板计数，其余细胞经200×g离心力作用下离心3-5分钟，弃上清液，加入冻存液重悬细胞，调整细胞浓度为1×106-5×106个细胞/ml。将细胞悬液分装至冻存管内，1ml/管，拧紧盖子。在管壁上标明细胞名称，冻存液名称，冻存日期等。将细胞冻存管放入已加好异丙醇的细胞程序降温盒内，置于-80℃条件下保存。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的细胞冻存液质量稳定，能够很好的解决由于血清品质差异导致的冻存效果不稳定难题。该细胞冻存液能够很好的缓解冻存过程中冰晶对细胞的伤害，该冻存液能够穿过猪胎儿成纤维细胞的细胞膜渗透到细胞内，增大胞内渗透压，降低冰点，延缓冻存过程。复苏后的细胞活力在83.33-95.33％，电转后细胞形态和增殖活力良好。采用该冻存液冻存猪胎儿成纤维细胞，复苏后的细胞转染效率高，可达90％以上，且该细胞冻存液成本低。附图说明图1为实施例6中的细胞生长状态图，其中，a、b、c分别为来源于冻存液1、冻存液2和冻存液7的细胞转染12小时的细胞生长状态图；图2为实施例6中的细胞转染效率图，其中，a、b、c分别为来源于冻存液1、冻存液2和冻存液7的细胞转染12小时的细胞转染率图。具体实施方式所举实施例是为了更好地对本专利技术的内容进行说明，但并不是本专利技术的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
技术实现思路
对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。以下实施例中的蔗糖为分析纯，来自成都市科龙化工试剂厂；DMEM基础培养基来自美国Gibco公司的DMEM基础培养基11995-065；乙二醇来自美国Sigma-Aldrich公司；二甲基亚砜来自美国Sigma-Aldrich公司的二甲基亚砜D4540；细胞程序降温盒来自美国Nalgene公司；标准胎牛血清为来自兰州百灵生物技术有限公司的Cellmax胎牛血清；特级胎牛血清为来自hyclone的SH30070.03。实施例1猪胎儿成纤维细胞冻存液的配制冻存液1(对照)：9ml标准胎牛血清加1ml二甲基亚砜，配制总体积为10ml的对照冻存液，现用现配，4℃存放备用。冻存液2(对照)：9ml特级胎牛血清加1ml二甲基亚砜，配制总体积为10ml的对照冻存液，现用现配，4℃存放备用。本专利技术所用冻存液(冻存液3-11)：0.2-1ml蔗糖浓储、1.5-2.5ml乙二醇、1.5-2.5ml二甲基亚砜以及适量DMEM基础培养基，配制总体积为10ml的冻存液，现用现配。具体配制如表1所示。其中，蔗糖浓储配制方法为：称取17.12g蔗糖，充分溶于10mlDMEM基础培养基，用0.22um过滤器过滤，1ml/管分装，-20℃保存。表1冻存液3-11实施例2猪胎儿成纤维细胞的制备在传统制备猪胎儿成纤维细胞的基础上，进行改良，具体方法如下：1)麻醉妊娠33天荣昌母猪，剖腹取出子宫，放入含双抗生理盐水(38℃)送往试验室；2)用体积分数为75％的酒精乳液浸泡清洗子宫1min，将子宫置于托盘，送往超净台；3)在超净台无菌取出胎儿置于100mm培养皿(含双抗PBS)；4)用PBS清洗胎本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪胎儿成纤维细胞冻存液，其特征在于，包括以下组分：蔗糖、乙二醇、二甲基亚砜和DMEM基础培养基。

【技术特征摘要】
1.一种猪胎儿成纤维细胞冻存液，其特征在于，包括以下组分：蔗糖、乙二醇、二甲基亚砜和DMEM基础培养基。2.根据权利要求1所述的一种猪胎儿成纤维细胞冻存液，其特征在于，所述蔗糖的终浓度为0.1-0.5mol/L。3.根据权利要求1所述的一种猪胎儿成纤维细胞冻存液，其特征在于，所述乙二醇的体积分数为15-25％，二甲基亚砜的体积分数为15-25％，DMEM基础培养基的体积分数为50-70％。4.权利要求1所述冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取蔗糖浓储、乙二醇、二甲基亚砜以及适量DMEM基础培养基，配制成冻存液；其中，蔗糖浓储配制方法为：称取蔗糖，溶于DMEM基础培养基，过滤，分装，于-20℃保存。5.根据根据要求4所述冻存...

【专利技术属性】
技术研发人员：游小燕，葛良鹏，邹贤刚，何琦琳，孙静，
申请(专利权)人：重庆市畜牧科学院，
类型：发明
国别省市：重庆,50