一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法技术

本发明专利技术提供了一种通过电击对鞘氨醇单胞菌进行遗传转化的方法。包括以下步骤：(1)提供鞘氨醇单胞菌KIB株；(2)电转鞘氨醇单胞菌所需载体的构建；(3)鞘氨醇单胞菌感受态细胞的制备；(4)电击转化感受态细胞；(5)转化后培养；(6)转化用于遗传改造效果的验证。其中，步骤(2)通过将鞘氨醇单胞菌内源质粒复制子与载体pHSG398连接，构建得到可以在鞘氨醇单胞菌体内复制的质粒。本发明专利技术所公开一种对鞘氨醇单胞菌进行遗传转化方法，其优点表现在：显著增强了对鞘氨醇单胞菌的转化效率与可重复性，并且操作简便，是对鞘氨醇单胞菌进行基因操作和研究的有效手段，为鞘氨醇单胞菌的基因工程育种、遗传学及分子生物学研究提供了方便、快速和高效的基因导入方法。可用于对鞘氨醇单胞菌降解芳香族化合物、胞外生产冷凝胶及胞内生产类胡萝卜素等机制的研究与工业化应用。

A method for genetic transformation of sphingosine bacteria

The present invention provides a method for genetic transformation of bacterial cells by electroporation. Includes the following steps: (1) provide Sphingomonas strain KIB; (2) to construct electric sphingobium required carrier; (3) sphingobium preparation of competent cells; (4) electroporation competent cells; (5) after the conversion of culture; (6) verification the transformation for genetic modification effect. Wherein, the step (2) constructs a plasmid that can be copied in the community of a gram positive bacterium by linking the endogenous plasmid replicon with the plasmid pHSG398. The invention discloses a method for genetic transformation of Sphingomonas, the utility model has the advantages of obvious reinforcement on the conversion efficiency of sphingobium and repeatability, and simple operation, is an effective means for gene manipulation and study of Sphingomonas, as Sphingomonas gene engineering breeding, genetics and molecular biology research provides a convenient, fast and efficient method of gene transfection. It can be used to study the mechanism of biodegradation of aromatic compounds, extracellular production of cold gel and intracellular production of carotenoid and its industrial application.

【技术实现步骤摘要】
一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种鞘氨醇单胞菌，以及一种通过电击对鞘氨醇单胞菌进行遗传转化的方法。
技术介绍
鞘氨醇单胞菌是一类丰富的新型微生物资源，其在地球上分布极其广泛，在各种水体，土壤，大气以及极端环境都有它存在的踪影。鞘氨醇单胞菌从属与a‐变形菌纲，鞘氨醇单胞菌目，鞘氨醇单胞菌科。该属菌株为革兰氏阴性菌，无孢子，以单侧生极性鞭毛运动，多呈黄色，专性需氧且能产生过氧化氢酶。鞘氨醇单胞菌自身具有很强的代谢能力，可以降解芳香族化合物，对于保护环境具有潜在应用价值；该属某些菌株胞外能够合成有价值的胞外生物高聚物，具有很高的经济利用价值；同时该属某些菌株胞内可以合成多种具较强抗氧化能力的类胡萝卜素，在工业生产上具有很高的应用价值。因此，鞘氨醇单胞菌目前受到了广泛的重视与研究。通过DNA重组技术向其导入外源DNA片段以研究鞘氨醇单胞菌降解芳香族化合物相关基因已成为研究其降解机制的重要手段，同时，根据应用微生物学，为提高生物高聚物，类胡萝卜素产量，将外源限速酶基因导入其体内也是一个重要应用手段。常见对鞘氨醇单胞菌的基因转化，是通过三亲结合的方法将外源基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鞘氨醇单胞菌，保藏号为CGMCC No.12394。

【技术特征摘要】
1.一种鞘氨醇单胞菌，保藏号为CGMCCNo.12394。2.一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，包括以下步骤：(1)构建电击转化鞘氨醇单胞菌所需质粒；(2)制备鞘氨醇单胞菌感受态细胞；(3)电击转化鞘氨醇单胞菌感受态细胞，转化后培养；(4)转化用于遗传改造效果的验证。3.根据权利要求2所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，其特征在于：步骤(1)中所述电击转化鞘氨醇单胞菌所需质粒是由将鞘氨醇单胞菌内源质粒复制子与pHSG398质粒连接所构成。4.根据权利要求3所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，其特征在于：所述步骤(1)中电击转化鞘氨醇单胞菌所需质粒是由将鞘氨醇单胞菌内源质粒或内源质粒上任何长度带有复制子的DNA片段或基本上同源的一段DNA序列与pHSG398质粒连接所构成。5.根据权利要求2所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，其特征在于：所述步骤(2)制备鞘氨醇单胞菌感受态细胞是将鞘氨醇单胞菌接种至LB培养基内，于28℃摇床孵育至吸光度OD600nm＝0.6-0.9，离心收集，使用预冷的10％甘油洗两遍，于-80℃冻存。6.根据权利要求2所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，其特征在于：所述步骤(3)电击转化鞘氨醇单胞菌感受态细胞，采用电击条件为2.0KV-2.5KV，脉冲时间为4.5-5.5ms。7.根据权利要求2所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，其特征在于：所述步骤(3)转化后培养是向电击后的鞘氨醇单胞菌感受态细胞加入TB培养基，震荡培养2-6小时。8.根据权利要求1所述的一种鞘氨醇单胞菌在对鞘氨醇单胞菌的遗传改造中的应用，其特征在于将由鞘氨醇单胞菌内源质粒上任意片段或基本同源的一段DNA序列组成的质粒，用于对鞘氨醇单胞菌的遗传改造。9.根据权利要求2所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，其特征在于：该方法包括下述步骤：(一)构建转化所必须的质粒：1、鞘氨醇单胞菌内源质粒的提取由常用质粒抽提试剂盒实现，将获得的内源质粒分别用限制性内切酶BamHⅠ，EcoRⅠ，SalⅠ进行消化，分别获得长度为6kb，5kb，3kb的DNA片段，其三者共同特征是都含有内源质粒的复制子；2、将带氯霉素抗性的质粒pHSG398分别用限制性内切酶BamHⅠ，EcoRⅠ，SalⅠ进行消化，与(1)获得的三种不同大小的DNA片段进行连接，构建得到三种不同大小的的质粒p...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘萌萌，黄俊潮，叶景润，赵启超，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53