一种快速检测传代干细胞恶性转化的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种快速检测传代干细胞恶性转化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括P16、RASSF1A、GSTP1和CDH1四个目的基因对应的引物及内参基因β‑actin引物。本发明专利技术在检测干细胞恶性转化方面，具有操作简单、准确性好及敏感性高的优点。

A kit for rapid detection of malignant transformation of stem cells

The present invention provides a kit for rapid detection of cultured stem cells malignant transformation, which is characterized in that the primer and reference gene beta actin primers the kit includes four genes P16, RASSF1A, GSTP1 and CDH1 corresponding. The invention has the advantages of simple operation, good accuracy and high sensitivity in detecting malignant transformation of stem cells.

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测传代干细胞恶性转化的试剂盒
本专利技术属于干细胞技术和肿瘤诊断领域，具体涉及一种快速检测传代干细胞恶性转化的试剂盒。
技术介绍
目前，干细胞发展如火如荼。干细胞治疗领域的发展，将帮助人类实现修复创伤和病理组织，治愈终末期疾病的梦想，有望解决人类面临的诸多重大医学难题。肿瘤的发生机制和细胞的起源是现今肿瘤学研究的热点和难点。肿瘤干细胞理论认为，肿瘤起源于与其自身组织或器官相关并具有其自身组织或器官特异性的干细胞的恶性转化。肿瘤的发生很可能是由于干细胞在长期的自我更新过程中发生基因突变，调控干细胞增殖分化的信号传导通路部分发生变化，干细胞在增殖分化过程中被不正常信号干扰而恶变为肿瘤干细胞，继而过度增殖形成肿瘤，干细胞常常是恶性转化的靶点细胞。但是，具体到某种肿瘤究竟由何种干细胞恶性转化产生，目前这方面的研究还比较少。DNA甲基化是一项重要的表观遗传学机制，在人类癌症发生发展中发挥着重要的作用。特定基因的启动子区甲基化异常引起了人们的广泛关注，被认为是癌症诊断的潜在标志物。在癌症中只有极少数的单独基因被证明是甲基化比例很高的。因此，检测一组基因的甲基化状态，与检测单独基因的甲基化状态相比，诊断灵敏度更高、特异性更好。至今人们已研究了多种癌症的甲基化谱。对于一个理想的甲基化谱而言，准确的检测方法和逻辑的数据分析都是必不可少的。2012年，已经建立了一种统计多个基因的甲基化水平的方法，根据候选基因的甲基化水平进行癌症样本和正常样本的逐步累积分析。与以前的统计方法相比，这个方法充分考虑了不同基因的甲基化程度和影响，然而，这个方法需要对大量样本进行统计分析，因此很难应用于即时单个样本或少量样本的诊断。
技术实现思路
针对现有技术的缺点，本专利技术提供了一种操作简单、准确性好及敏感性高的试剂盒。该试剂盒包括P16、RASSF1A、GSTP1和CDH1四个目的基因对应的引物及内参基因β-actin引物，具体引物序列如下：目的基因P16正向引物：TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC目的基因P16反向引物：GACCCCGAACCGCGACCGTAA目的基因RASSF1A正向引物：GACCTCTGTGGCGACTTCATCTG目的基因RASSF1A反向引物：GACCTAGTCCTCGGGAGCTGTC目的基因GSTP1正向引物：TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC目的基因GSTP1反向引物：GCCCCAATACTAAATCACGACG目的基因CDH1正向引物：TTAGGTTAGAGGGTTATCGCGT目的基因CDH1反向引物：TAACTAAAAATTCACCTACCGAC内参基因β-actin正向引物：GTGATGGAGGAGGTTTAG内参基因β-actin反向引物：AAATTACAAAAACCACAA。还包括所述四个目的基因P16、RASSF1A、GSTP1和CDH1甲基化位点对应的探针以及内参基因β-actin对应的探针，具体核苷酸序列如下：目的基因P16探针：FAM-AGTAGTATGGAGTCGGCGGCGGG-TAMRA目的基因RASSF1A探针：FAM-CCCTCTGCCGCGACTTGACCCG-TAMRA目的基因GSTP1探针：FAM-CGGGGTGTAGCGGTCG-TAMRA目的基因CDH1探针：FAM-TCGCGGGGTTCGTTTTTCGC-TAMRA内参基因β-actin探针：FAM-CACCACCCAACACACAAT-TAMRA。本专利技术所述试剂盒还包括PCR反应液、重亚硫酸盐。本专利技术所述PCR反应液包括DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR缓冲液和Mg2+。所述干细胞包括肿瘤干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的任意一种或多种。所述肿瘤干细胞包括肺癌干细胞、胃癌干细胞、肝癌干细胞、结肠癌干细胞中的一种或多种。本专利技术的有益效果：本专利技术在检测干细胞恶性转化方面，具有操作简单、准确性好及敏感性高的优点。附图说明图1为RT-PCR方法目的基因及内存基因扩增曲线图；图2为未发生恶性转化干细胞培养20天后细胞形态；图3为发生恶性转化干细胞培养90天后细胞形态。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本专利技术进行进一步的说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述
技术实现思路
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。实施例1本实施例采用的Taq酶购于大连宝生物公司(TaKaRa)；细胞基因组提取试剂盒为AxyPrepTMMultisourceGenomicDNAMiniprepKit(AxygenScientific,Inc.CA,USA)；硫化试剂盒为，EZDNAMethylationkit(ZymoResearch,Orange,CA,USA)；其他试剂为国产分析纯试剂。本实施例所采用的干细胞为不同癌症组织分离的干细胞。本实施例所涉及到的引物为：目的基因P16正向引物：TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC目的基因P16反向引物：GACCCCGAACCGCGACCGTAA目的基因RASSF1A正向引物：GACCTCTGTGGCGACTTCATCTG目的基因RASSF1A反向引物：GACCTAGTCCTCGGGAGCTGTC目的基因GSTP1正向引物：TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC目的基因GSTP1反向引物：GCCCCAATACTAAATCACGACG目的基因CDH1正向引物：TTAGGTTAGAGGGTTATCGCGT目的基因CDH1反向引物：TAACTAAAAATTCACCTACCGAC内参基因β-actin正向引物：GTGATGGAGGAGGTTTAG内参基因β-actin反向引物：AAATTACAAAAACCACAA。方法：一.干细胞提取DNA流程(DNA提取试剂盒，AxyPrepTMMultisourceGenomicDNAMiniprepKit(AxygenScientific,Inc.CA,USA))1.离心细胞：2000转/分钟离心细胞悬液2分钟，收集细胞，倒掉上层液体，加入4℃预冷的PBS200ul，2000转/分钟离心细胞悬液2分钟，收集细胞，倒掉上层液体，加入200ulPBS溶解细胞。2.加入25ulOB蛋白酶溶解液，混匀。3.加入220ulBLBuffer4.70℃水浴10min。5.加入220ul无水乙醇混匀6.将收集柱放入2ml收集管中，把步骤5中的液体加入收集柱中，7.最大转速离心1min，大于等于10000转倒掉收集管中废液8.收集管中加入500ulHBCBuffer最大转速(大于等于10000转)离心30s，9.加入700ulDNAWashBuffer最大转速(大于等于10000转)离心30s(2遍)10.空离心收集管最大转速(大于等于10000转)离心2min11.加入100uldd水(加热到70℃)12.静置2min，大转速(大于等于10000转)离心1min，收集DNA，测定浓度。二、DNA硫化流程(DNA硫化试剂盒，ZYMO公司的EZDNAMethylation-GoldTMKitcatalogNos.D500本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测传代干细胞恶性转化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括P16、RASSF1A、GSTP1和CDH1四个目的基因对应的引物及内参基因β‑actin引物，具体引物序列如下：目的基因P16正向引物：TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC目的基因P16反向引物：GACCCCGAACCGCGACCGTAA目的基因RASSF1A正向引物：GACCTCTGTGGCGACTTCATCTG目的基因RASSF1A反向引物：GACCTAGTCCTCGGGAGCTGTC目的基因GSTP1正向引物：TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC目的基因GSTP1反向引物：GCCCCAATACTAAATCACGACG目的基因CDH1正向引物：TTAGGTTAGAGGGTTATCGCGT目的基因CDH1反向引物：TAACTAAAAATTCACCTACCGAC内参基因β‑actin正向引物：GTGATGGAGGAGGTTTAG内参基因β‑actin反向引物：AAATTACAAAAACCACAA。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测传代干细胞恶性转化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括P16、RASSF1A、GSTP1和CDH1四个目的基因对应的引物及内参基因β-actin引物，具体引物序列如下：目的基因P16正向引物：TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC目的基因P16反向引物：GACCCCGAACCGCGACCGTAA目的基因RASSF1A正向引物：GACCTCTGTGGCGACTTCATCTG目的基因RASSF1A反向引物：GACCTAGTCCTCGGGAGCTGTC目的基因GSTP1正向引物：TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC目的基因GSTP1反向引物：GCCCCAATACTAAATCACGACG目的基因CDH1正向引物：TTAGGTTAGAGGGTTATCGCGT目的基因CDH1反向引物：TAACTAAAAATTCACCTACCGAC内参基因β-actin正向引物：GTGATGGAGGAGGTTTAG内参基因β-actin反向引物：AAATTACAAAAACCACAA。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括所述四个目的基因P16、RASSF1A、...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻堃，徐国锋，
申请(专利权)人：成都睿杰森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51