在选定的细胞亚群中鉴别多个表位的方法技术

本发明专利技术公开了用于鉴别混合细胞群体内的亚群的方法。所述方法包括使所述混合细胞群体与至少一种独特结合剂接触，其中所述至少一种独特结合剂被设计成与所述亚群中存在的靶分子结合，并且其中所述至少一种独特结合剂附接至代表所述靶分子的身份的表位特异性条码。所述方法进一步包括将两个或更多个可测定聚合物亚单位依次附接至所述表位特异性条码，以创建与所述至少一种独特结合剂结合的、代表个体细胞的身份的独特细胞起源条码；以及将所述表位特异性条码和细胞起源条码解码，从而鉴别所述混合细胞群体内的亚群。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在选定的细胞亚群中鉴别多个表位的方法交叉引用本申请要求提交于2014年12月19日的第62/094,917号美国临时申请、提交于2014年12月19日的第62/094,919号美国临时申请以及提交于2014年12月19日的第62/094,924号美国临时申请的权益，所有这些申请都通过引用以其全文并入本文以用于所有目的。专利技术背景虽然人体中的所有细胞都含有相同的遗传物质，但同组的基因并非在所有这些细胞中都是活性的。基因表达模式的改变可对生物学功能具有深远的影响。了解基因产物(蛋白质)产生和调节的动力学及其相互作用对于了解例如遗传和/或环境诱导的健康障碍的机制将是至关重要的，并且可能为发现新的诊断和治疗靶标提供基础。因此，用于在个体细胞中监测基因表达谱和检测完整蛋白质的特定变体(例如，剪接变体、点突变、翻译后修饰以及环境或治疗诱导的修饰)的技术，以及用于随时间定量其水平的技术，可能有助于开发新的诊断和治疗程序。此外，在单个细胞中同时对多个而不仅是一个靶分子进行这些分析正变得越来越重要。目前可用的方法常需要大量的生物样品，并且/或者将不提供细胞特异性信息。另外，由于复杂样品分析中固有的挑战，进行多重测量常常是特别困难的。因此，对能够精确和灵敏地对复杂细胞群体的个体细胞中的靶分子进行检测、鉴别和定量的方法存在需要。此外，常常期望对样品中选定细胞亚群的个体细胞进行这些分析，并保留关于一种或多种靶分子的存在与否的细胞特异性信息。
技术实现思路
本公开内容描述了用于检测单个细胞中的多个靶核酸序列的方法、组合物和试剂盒。所公开的方法总体上适用于检测核酸靶分子，并且特别适用于检测存在于细胞混合物中的单个细胞中的mRNA靶分子，其中个体细胞的起源信息得到保留。本文公开了用于鉴别单个细胞中的靶核酸分子的方法，该方法包括：a)提供第一寡核苷酸邻近探针(proximityprobe)，其包含表位特异性条码序列和能够与靶核酸序列的第一区段杂交的第一靶标识别序列；b)提供第二寡核苷酸邻近探针，其包含能够与靶核酸序列的第二区段杂交的第二靶标识别序列，其中靶核酸序列的第一区段和第二区段是不同的并且彼此相隔指定数目N个核苷酸；以及c)提供桥寡核苷酸，其包含两个探针识别序列，其中第一探针识别序列能够与第一寡核苷酸邻近探针的区段杂交，并且第二探针识别序列能够与第二寡核苷酸邻近探针的区段杂交，从而创建包含所述表位特异性条码的靶标特异性探针复合物。在一些实施方案中，采用连接酶或聚合酶反应将所述第一和第二邻近探针与桥寡核苷酸共价接合。在一些实施方案中，所述方法进一步包括以有序的方式将两个或更多个可测定聚合物亚单位附接至所述靶标特异性探针复合物，以创建代表所述单个细胞的身份的独特细胞起源条码。在一些实施方案中，所述两个或更多个可测定聚合物亚单位在连续轮次的裂分-合并合成(split-poolsynthesis)中附接至所述靶标特异性探针复合物。在一些实施方案中，所述附接包括与寡核苷酸模板分子的杂交，其中该模板分子的一端与所述靶标特异性探针复合物互补，并且其中在杂交后采用连接酶反应将所述可测定聚合物亚单位与靶标特异性探针复合物共价接合。在一些实施方案中，所述寡核苷酸模板分子包含位于所述模板分子序列中与所述可测定聚合物亚单位杂交的部分之间的终止代码序列，从而抑制所述寡核苷酸模板分子在扩增反应期间的扩增。在一些实施方案中，所述终止代码序列包括聚-dT序列。在一些实施方案中，所述终止代码序列包括聚-T序列。在一些实施方案中，所述终止代码序列包括三碳连接体。在一些实施方案中，所述第一或第二寡核苷酸邻近探针的至少一种进一步包含一种或多种引物序列。在一些实施方案中，所述细胞起源条码进一步包含一种或多种引物序列。在一些实施方案中，至少一种所述引物序列为扩增引物序列。在一些实施方案中，所公开的方法进一步包括对整套细胞起源条码及其相关的表位特异性条码的一部分或全部进行扩增和测序。在一些实施方案中，至少一种所述引物序列为测序引物序列。在一些实施方案中，所述靶核酸分子为DNA分子。在一些实施方案中，所述靶核酸分子为RNA分子。在一些实施方案中，该RNA分子为mRNA分子。在一些实施方案中，所述寡核苷酸邻近探针为DNA分子。在一些实施方案中，所述寡核苷酸邻近探针的长度为10至200个核苷酸。在一些实施方案中，所述靶标识别序列的长度为5至50个核苷酸。在一些实施方案中，所述表位特异性条码的长度为5至50个核苷酸。在一些实施方案中，N在1至20之间。在一些实施方案中，N在20至40之间。在一些实施方案中，N在40至100之间。在一些实施方案中，所述桥寡核苷酸为DNA分子。在一些实施方案中，所述桥分子的探针识别序列的长度为5至50个核苷酸。在一些实施方案中，所述可测定聚合物亚单位包含核酸序列。在一些实施方案中，所述方法是多重的(multiplexed)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括额外的引物与所述细胞起源条码的末端的附接。在一些实施方案中，所述寡核苷酸邻近探针之一进一步包含所述桥寡核苷酸。在一些实施方案中，所述桥寡核苷酸用作用于附接一个或多个可测定聚合物亚单位的模板分子。在一些实施方案中，使用两个或更多个模板分子来组装所述细胞起源条码。本文还公开了用于检测靶mRNA序列的方法，该方法包括：(a)裂解细胞样品以释放mRNA；(b)使裂解的细胞样品与多个珠子接触，其中珠子包含能够与所释放的mRNA分子杂交的多个栓系的(tethered)寡核苷酸序列；(c)使第一寡核苷酸邻近探针与所述多个珠子上所杂交的mRNA分子退火，其中第一寡核苷酸邻近探针包含表位特异性条码序列和能够与靶核酸序列的第一区段杂交的第一靶标识别序列；(d)使第二寡核苷酸邻近探针与所述多个珠子上所杂交的mRNA分子退火，其中第二寡核苷酸邻近探针包含能够与靶核酸序列的第二区段杂交的第二靶标识别序列，并且其中靶核酸序列的第一和第二区段是不同的并且彼此相隔指定数目N个核苷酸；(e)使桥寡核苷酸与所述多个珠子上所杂交的寡核苷酸邻近探针退火，其中该桥寡核苷酸包含两个探针识别序列，其中第一探针识别序列能够与第一寡核苷酸邻近探针的区段杂交，并且第二探针识别序列能够与第二寡核苷酸邻近探针的区段杂交，从而创建包含所述表位特异性条码的靶标特异性探针复合物；以及(f)将退火的寡核苷酸邻近探针与桥寡核苷酸连接，以创建共价接合的靶标特异性探针复合物。在一些实施方案中，所述多个栓系的寡核苷酸序列进一步包含一个或多个引物序列。在一些实施方案中，所述多个栓系的寡核苷酸序列包含聚-dT靶标识别序列。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使用一种或多种靶标特异性引物扩增包含所述表位特异性条码的所述靶标特异性探针复合物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对扩增产物进行测序，以检测或定量一种或多种mRNA序列的存在与否。本文公开了一种组合物，其包含：(a)第一寡核苷酸邻近探针，其包含表位特异性条码和第一靶标识别序列，其中第一靶标识别序列能够与靶核酸分子序列的第一区段杂交；(b)第二寡核苷酸邻近探针，其包含第二靶标识别序列，其中第二靶标识别序列能够与靶核酸分子序列的第二区段杂交；以及(c)桥寡核苷酸，其包含第一和第二探针识别序列，其中第一探针识别序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴别混合细胞群体内的亚群的方法，所述方法包括：a)使所述混合细胞群体与至少一种独特结合剂接触，其中所述至少一种独特结合剂被设计成与所述亚群中存在的靶分子结合，并且其中所述至少一种独特结合剂附接至代表所述靶分子的身份的表位特异性条码；b)将两个或更多个可测定聚合物亚单位依次附接至所述表位特异性条码，以创建与所述至少一种独特结合剂结合的、代表个体细胞的身份的独特细胞起源条码；以及c)将所述表位特异性条码和细胞起源条码解码，从而鉴别所述混合细胞群体内的亚群。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.19 US 62/094,924;2014.12.19 US 62/094,919;1.一种用于鉴别混合细胞群体内的亚群的方法，所述方法包括：a)使所述混合细胞群体与至少一种独特结合剂接触，其中所述至少一种独特结合剂被设计成与所述亚群中存在的靶分子结合，并且其中所述至少一种独特结合剂附接至代表所述靶分子的身份的表位特异性条码；b)将两个或更多个可测定聚合物亚单位依次附接至所述表位特异性条码，以创建与所述至少一种独特结合剂结合的、代表个体细胞的身份的独特细胞起源条码；以及c)将所述表位特异性条码和细胞起源条码解码，从而鉴别所述混合细胞群体内的亚群。2.如权利要求1所述的方法，其中所述表位特异性条码和所述可测定聚合物亚单位包含寡核苷酸序列。3.如权利要求1所述的方法，其中采用裂分-合并组合合成法将所述两个或更多个可测定聚合物亚单位附接至所述表位特异性条码。4.如权利要求2所述的方法，其中将每次出现的所述表位特异性条码与相关细胞起源条码的所述两个或更多个可测定聚合物亚单位连接以形成可被扩增和测序的缀合物。5.如权利要求4所述的方法，其进一步包括表位特异性条码-细胞起源条码缀合物的扩增。6.如权利要求5所述的方法，其中所述解码步骤包括对扩增的表位特异性条码-细胞起源条码缀合物的一部分或全部进行测序。7.如权利要求6所述的方法，其中与所述亚群相关的细胞起源条码的数目与所述混合群体中的细胞总数之比提供了所述混合群体内含有所述靶分子的细胞比例的量度。8.如权利要求6所述的方法，其中使用两种或更多种独特结合剂来鉴别所述亚群。9.如权利要求6所述的方法，其中使用两种或更多种独特结合剂来鉴别两个或更多个亚群。10.如权利要求8所述的方法，其中至少一种所述独特结合剂被设计成与选自DNA、组蛋白和管家蛋白质的靶分子结合。11.如权利要求10所述的方法，其中所述至少一种独特结合剂为针对选自DNA、组蛋白和管家蛋白质的靶分子的抗体或...

【专利技术属性】
技术研发人员：盖瑞·P·诺兰，
申请(专利权)人：爱普瑞斯生物公司，
类型：发明
国别省市：美国,US