本发明专利技术涉及一种用于检测呼吸道病原体的引物组合物，其包括肺炎支原体引物组、肺炎衣原体引物组、甲/乙型流感病毒引物组、副流感病毒引物组、腺病毒引物组、呼吸道合胞病毒引物组中的至少一组；还涉及一种包含该引物组合物的试剂盒，其还包括包披引物的微流控芯片、肉眼可见指示剂；还涉及一种采用上述引物组合物的检测方法，包括引物组合物的包被、待检样品核酸提取、LAMP反应和可视化结果判读。本发明专利技术提供的试剂盒及方法运用在微流控芯片上进行可视化判定，快速准确地实现7种呼吸道病原体的即时检测，通过颜色变化肉眼判定结果，这使本发明专利技术在实际应用中更加简便、快捷、并且容易操作、适用于现场操作。
【技术实现步骤摘要】
一种检测呼吸道病原体的LAMP引物组合物及其试剂盒
本专利技术属于核酸扩增
，具体涉及一种用于检测呼吸道病原体的LAMP引物组合物，以及基于微流控芯片系统的检测呼吸道病原体的试剂盒及其方法。
技术介绍
呼吸道感染是我国常见的一种传染病，是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统。上呼吸道感染主要有病毒引起，指鼻腔、咽或喉部炎症，最常见的是急性上呼吸道感染，有较强的传染性也可引起严重并发症。下呼吸道感染由病毒、细菌、支原体、衣原体等微生物引起，下呼吸道感染包括支气管炎、肺炎等，治疗时若能明确引起感染的病原体，则可以选择有效的抗生素或抗病毒治疗。同时现今非典型呼吸道病原体在呼吸道病原体中占比越来越大，并且存在多重感染的情况。因此实现快速检测，多病原体检测已成为趋势。目前临床上应用的鉴定病原体的方法主要是依靠培养检测，但是培养法检测时间差，准确性低，同时呼吸道病原体很多较难培养。而且该类疾病具有相似的临床症状和流行性特征，并且存在多重感染的情况。呼吸道联检试剂Pneumoslide为西班牙VIRCELL公司生产，1卡可同时检测人血清中呼吸道感染9项IgM抗体，包括嗜肺军团菌1型(LP1)、肺炎支原体(MP)、Q热立克次体(COX)、肺炎衣原体(CP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(IFA)、乙型流感病毒(IFB)、副流感病毒(PIV)，但结果需用免疫荧光显微镜观察，对辨别阴阳性需要较长时间进行分辨。微流控技术是以微加工技术实现微体积反应，用以取代常规分子生物学、化学、免疫学或药物分析反应，并可实现多通量或高通量反应使得实验检测成本大幅降低，显著提高效率。环介导恒温扩增根据链置换DNA聚合酶的扩增特性以及特异性引物(针对靶序列6个区域设计的4条特异性引物)，利用链置换DNA聚合酶保证引物在等温条件下顺利与模板结合并进行扩增反应，与聚合酶链式反应有等同的特异性和灵敏度，可实现在恒温条件下的连续快速扩增，同时还可添加环引物，提高扩增效率，优于PCR。相关呼吸道病原体检测技术主要为间接免疫荧光法，胶体金法、酶联免疫法以及荧光PCR法。其中，间接免疫荧光法判定结果需要借助荧光显微镜，而且判定结果需要检测人员经验丰富；胶体金检测虽然快速，但是灵敏度不高，容易出现假阴性结果。酶联免疫检测的特异性和灵敏度不高，操作过程繁琐，耗时费力。荧光PCR法能够较准确的检测病原体核酸，但多重荧光PCR产品检测靶点最多3个，检测时间长，检测体系和操作过程比较复杂，难以实行现场检测，需要专业人员操作特定检测仪器等问题。目前许多研究将环介导恒温扩增与微流控芯片结合，对病原体核酸、肿瘤标记基因、耐药位点等进行快速检测，但是以上研究需要借助其他仪器对结果进行判定。因此，目前面临的技术性难点在于研发一款在可以同时检测多种呼吸道病原体，并且便于判定结果的系统。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种用于检测呼吸道病原体的LAMP引物组合物及其试剂盒和方法，其采用微流控芯片实现7种感染率较高的非典型呼吸道病原体(肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲/乙型流感病毒(IFA&IFB，共检)、副流感病毒(PIV))的并行分析，并同步肉眼显色判定，提高呼吸道相关病原体的检测通量以及可操作性，降低成本，缩短检测时间。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一方面，本专利技术提供一种用于检测呼吸道病原体的LAMP引物组合物，其包括肺炎支原体引物组、肺炎衣原体引物组、甲/乙型流感病毒引物组、副流感病毒引物组、腺病毒引物组、呼吸道合胞病毒引物组中的至少一组；其中，所述肺炎支原体引物组包括SEQIDNO：1所示的肺炎支原体外引物1、SEQIDNO：2所示的肺炎支原体外引物2、SEQIDNO：3所示的肺炎支原体内引物1和SEQIDNO：4所示的肺炎支原体内引物2；其中，所述肺炎衣原体引物组包括SEQIDNO：5所示的肺炎衣原体外引物1、SEQIDNO：6所示的肺炎衣原体外引物2、SEQIDNO：7所示的肺炎衣原体内引物1和SEQIDNO：8所示的肺炎衣原体内引物2；其中，所述甲/乙型流感病毒引物组包括SEQIDNO：9所示的甲/乙型流感病毒外引物1、SEQIDNO：10所示的甲/乙型流感病毒外引物2、SEQIDNO：11所示的甲/乙型流感病毒内引物1和SEQIDNO：12所示的甲/乙型流感病毒内引物2；其中，所述副流感病毒引物组包括SEQIDNO：13所示的副流感病毒外引物1、SEQIDNO：14所示的副流感病毒外引物2、SEQIDNO：15所示的副流感病毒内引物1和SEQIDNO：16所示的副流感病毒内引物2；其中，所述腺病毒引物组引物组包括SEQIDNO：17所示的腺病毒引物组外引物1、SEQIDNO：18所示的腺病毒引物组外引物2、SEQIDNO：19所示的腺病毒引物组内引物1和SEQIDNO：20所示的腺病毒引物组内引物2；其中，所述呼吸道合胞病毒引物组包括SEQIDNO：21所示的呼吸道合胞病毒外引物1、SEQIDNO：22所示的呼吸道合胞病毒外引物2、SEQIDNO：23所示的呼吸道合胞病毒内引物1和SEQIDNO：24所示的呼吸道合胞病毒内引物2。为了进一步优化上述技术方案，本专利技术所采取的技术措施还包括：优选地，该LAMP引物组合物进一步包括质控引物组，所述质控引物组包括SEQIDNO：25所示的质控外引物1、SEQIDNO：26所示的质控外引物2、SEQIDNO：27所示的质控内引物1和SEQIDNO：28所示的质控内引物2。上述呼吸道病原体引物组的引物序列及质控引物组的序列如下所示：表1扩增引物序列表另一方面，本专利技术提供一种含有上述LAMP引物组合的试剂盒，其还包括微流控芯片，所述微流控芯片设有互不连通的4个反应检测部分，每一反应检测部分均包括依次连通的储液区、预留区、球阀和反应孔，所述储液区设置加样孔，每个反应检测部分具有8个反应孔，所述引物组合物中的每一引物组分别包被于对应的反应孔中。为了进一步优化上述技术方案，本专利技术所采取的技术措施还包括：优选地，所述微流控芯片为圆盘形微流控芯片。优选地，每一引物组中外引物1的浓度为50μM，外引物2的浓度为50μM，内引物1的浓度为50μM，内引物2的浓度为50μM；其中，在该试剂盒中，所述外引物1、外引物2、内引物1、内引物2的体积比为1:1:4～8:4～8。优选地，所述试剂盒进一步包括反应液、DNA聚合酶、指示剂、阴性对照物。优选地，所述反应液包括10～15mMdNTPs、10×IsothermalAmplification反应缓冲液、100～200mmMMgSO4水溶液；其中，所述反应液中dNTPs、反应缓冲液、MgSO4水溶液的体积比为7～9:4～6:2。优选地，所述反应液包括12mMdNTPs、10×IsothermalAmplification反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液；其中，所述反应液中dNTPs、反应缓冲液、MgSO4水溶液的体积比为7～9:4～6:2，更优选为8：5：2。优选地，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，浓度为8U/μl。优选地，所述指示剂包括本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测呼吸道病原体的LAMP引物组合物，其特征在于，包括肺炎支原体引物组、肺炎衣原体引物组、甲/乙型流感病毒引物组、副流感病毒引物组、腺病毒引物组、呼吸道合胞病毒引物组中的至少一组；其中，所述肺炎支原体引物组包括SEQ ID NO：1所示的肺炎支原体外引物1、SEQ ID NO：2所示的肺炎支原体外引物2、SEQ ID NO：3所示的肺炎支原体内引物1和SEQ ID NO：4所示的肺炎支原体内引物2；其中，所述肺炎衣原体引物组包括SEQ ID NO：5所示的肺炎衣原体外引物1、SEQ ID NO：6所示的肺炎衣原体外引物2、SEQ ID NO：7所示的肺炎衣原体内引物1和SEQ ID NO：8所示的肺炎衣原体内引物2；其中，所述甲/乙型流感病毒引物组包括SEQ ID NO：9所示的甲/乙型流感病毒外引物1、SEQ ID NO：10所示的甲/乙型流感病毒外引物2、SEQ ID NO：11所示的甲/乙型流感病毒内引物1和SEQ ID NO：12所示的甲/乙型流感病毒内引物2；其中，所述副流感病毒引物组包括SEQ ID NO：13所示的副流感病毒外引物1、SEQ ID NO：14所示的副流感病毒外引物2、SEQ ID NO：15所示的副流感病毒内引物1和SEQ ID NO：16所示的副流感病毒内引物2；其中，所述腺病毒引物组引物组包括SEQ ID NO：17所示的腺病毒引物组外引物1、SEQ ID NO：18所示的腺病毒引物组外引物2、SEQ ID NO：19所示的腺病毒引物组内引物1和SEQ ID NO：20所示的腺病毒引物组内引物2；其中，所述呼吸道合胞病毒引物组包括SEQ ID NO：21所示的呼吸道合胞病毒外引物1、SEQ ID NO：22所示的呼吸道合胞病毒外引物2、SEQ ID NO：23所示的呼吸道合胞病毒内引物1和SEQ ID NO：24所示的呼吸道合胞病毒内引物2。...
【技术特征摘要】
1.一种用于检测呼吸道病原体的LAMP引物组合物，其特征在于，包括肺炎支原体引物组、肺炎衣原体引物组、甲/乙型流感病毒引物组、副流感病毒引物组、腺病毒引物组、呼吸道合胞病毒引物组中的至少一组；其中，所述肺炎支原体引物组包括SEQIDNO：1所示的肺炎支原体外引物1、SEQIDNO：2所示的肺炎支原体外引物2、SEQIDNO：3所示的肺炎支原体内引物1和SEQIDNO：4所示的肺炎支原体内引物2；其中，所述肺炎衣原体引物组包括SEQIDNO：5所示的肺炎衣原体外引物1、SEQIDNO：6所示的肺炎衣原体外引物2、SEQIDNO：7所示的肺炎衣原体内引物1和SEQIDNO：8所示的肺炎衣原体内引物2；其中，所述甲/乙型流感病毒引物组包括SEQIDNO：9所示的甲/乙型流感病毒外引物1、SEQIDNO：10所示的甲/乙型流感病毒外引物2、SEQIDNO：11所示的甲/乙型流感病毒内引物1和SEQIDNO：12所示的甲/乙型流感病毒内引物2；其中，所述副流感病毒引物组包括SEQIDNO：13所示的副流感病毒外引物1、SEQIDNO：14所示的副流感病毒外引物2、SEQIDNO：15所示的副流感病毒内引物1和SEQIDNO：16所示的副流感病毒内引物2；其中，所述腺病毒引物组引物组包括SEQIDNO：17所示的腺病毒引物组外引物1、SEQIDNO：18所示的腺病毒引物组外引物2、SEQIDNO：19所示的腺病毒引物组内引物1和SEQIDNO：20所示的腺病毒引物组内引物2；其中，所述呼吸道合胞病毒引物组包括SEQIDNO：21所示的呼吸道合胞病毒外引物1、SEQIDNO：22所示的呼吸道合胞病毒外引物2、SEQIDNO：23所示的呼吸道合胞病毒内引物1和SEQIDNO：24所示的呼吸道合胞病毒内引物2。2.根据权利要求1所述的用于检测呼吸道病原体的LAMP引物组合物，其特征在于，进一步包括质控引物组，所述质控引物组包括SEQIDNO：25所示的质控外引物1、SEQIDNO：26所示的质控外引物2、SEQIDNO：27所示的质控内引物1和SEQIDNO：28所示的质控内引物2。3.一种含有权利要求1或2所述的LAMP引物组合物的试剂盒，其特征在于，还包括微流控芯片，所述微流控芯片设有互不连通的4个反应检测部分，每一反应检测部分均包括依...
【专利技术属性】
技术研发人员：方雪恩，王欣珍，王雄，杨茜，孔继烈，
申请(专利权)人：上海速创诊断产品有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。