一种用于临床样本PCR检测的快速提取核酸方法技术

本发明专利技术涉及一种用于临床样本PCR检测的快速提取核酸方法。该方法适用于提取革兰氏阴性菌、病毒、支原体和衣原体等病原微生物的DNA，提取产物DNA可用于荧光定量PCR检测。该发明专利技术将含有革兰氏阴性菌、病毒、支原体和衣原体等病原微生物的样本用生理盐水洗一次，在沉淀中加入含Chelex‑100、NaOH、SDS的溶液，重悬，再加入一定pH的醋酸钾溶液，离心后，取上清用于荧光定量PCR检测。与现有的核酸提取方法比较：(1)省去了蛋白酶K水解和柱纯化的步骤，大大缩短了核酸提取的时间；(2)避免了操作过程中因样本转移导致的交叉污染和DNA丢失现象，提高了检测结果的准确性。

Rapid nucleic acid extraction method for PCR detection of clinical samples

The present invention relates to a rapid method for extracting nucleic acid for PCR detection of clinical samples. The method is suitable for extracting DNA of pathogenic microorganisms such as gram negative bacteria, viruses, mycoplasma and chlamydia, and the extracted product DNA can be used for quantitative PCR detection. This invention will contain the gram negative bacteria, virus, mycoplasma and Chlamydia pathogenic microorganism samples washed once with saline, in the precipitate containing Chelex 100, NaOH, SDS solution, suspension, potassium acetate solution, then adding some pH after centrifugation, the supernatant for fluorescent quantitative PCR detection. Compared with the existing nucleic acid extraction method: (1) K protease hydrolysis and column purification steps saved, greatly shorten the extraction time of nucleic acid; (2) to avoid the operation process for sample transfer caused by cross contamination and DNA loss, improve the accuracy of test results.

【技术实现步骤摘要】
一种用于临床样本PCR检测的快速提取核酸方法
本专利技术属于分子生物学和医学检测领域，涉及一种用于临床样本PCR检测的快速提取核酸方法，具体是指采用简便可靠的方法抽提临床样本DNA，再采用荧光定量PCR方法对抽提的核酸进行检测。
技术介绍
核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要从复杂多样的生物样本中迅速有效地分离和提取所需要的基因组核酸，而且抽提后的核酸质量及其完整性都会直接影响到随后的实验结果。目前，用于临床样本PCR检测的提取核酸常用抽提方法包括：煮沸法、碱抽提法和异硫氰酸胍-柱纯化抽提法。煮沸法是在高温条件下将细胞裂解，再结合Chelex-100金属离子螯合剂提取核酸。Chelex-100对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用，能够抑制核酸酶对DNA的消化作用，防止了DNA在煮沸过程中的降解,这样的处理过程既达到了分离提取DNA的目的。但是，煮沸法易发生蹦盖现象，造成交叉污染，且杂质较多，影响PCR的扩增。异硫氰酸胍-柱纯化抽提法是用异硫氰酸胍裂解细胞后，将核酸吸附在离心柱膜上，通过加入不同洗涤试剂并反复离心，以达到核酸和杂质分离的目的，获得纯化的核酸。但此方法试剂耗材成本较高，且需要反复离心，不便于高通量、自动化操作。碱抽提方法是用碱和十二烷基磺酸盐使细胞裂解，碱可以在保持共价闭合环状DNA双链状态的同时，使高分子量染色体DNA变性，十二烷基磺酸盐与细胞蛋白、破碎的细胞壁和变性的染色体DNA形成复合物，离心后这些复合物沉淀，而质粒DNA存在于上清中。虽然这种方法最初只适用于提取质粒DNA，具有局限性。但是，经不断优化和改进，碱抽提法已广泛用于动物、植物、微生物和法医研究的各个领域。碱裂解法具有操作简便、提取速度快、通量大的特点，被认为是一种有效的DNA快速提取方法。
技术实现思路
本专利技术为解决传统核酸提取方法存在的缺陷，提出一种用于临床样本PCR检测的快速提取核酸的方法。为了实现本专利技术的专利技术目的，所采用的技术方案为一种用于临床样本PCR检测的快速提取核酸的方法，所述的方法包括以下步骤：1.取少量生物样本，所述生物样本选自细菌、病毒、支原体、衣原体感染的拭子、宫颈刷或液基细胞样本。2.取0.5ml样本加入1.5mlEP管中，12000rmp离心2min。3.小心弃上清，加入1ml生理盐水，旋涡振荡器上振荡打散沉淀(必要时用枪头轻轻打散沉淀)，12000rpm离心2-5min。4.小心弃上清，加入50-80ul含5％-10％Chelex-100、0.2-0.4MNaOH、1％-5％SDS、pH＝11-13的溶液P1重悬细胞。注意：用移液枪温柔吹散沉淀细胞，盖紧管盖，温和地混合，不要剧烈震荡，溶液应变清亮。5.加入5-10ulpH＝4.8-5.7的醋酸钾溶液P2，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀(可用手指轻轻弹EP管底数次)，见白色絮状沉淀，12000rmp离心1-5min，上清液直接用于PCR反应。其中，本专利技术的第一优先技术方案为，所述的加入生理盐水后离心时间为2-5min，优选4-5min；本专利技术的第二优先技术方案为，所述的溶液P1的加入量为50-80ul，优选50-60ul。本专利技术的第三优先技术方案为，所述的溶液P1中Chelex-100的浓度为5％-10％，优选5％-8％。本专利技术的第四优先技术方案为，所述的溶液P1中NaOH的浓度为0.2-0.4M，优选0.2-0.3M。本专利技术的第五优先技术方案为，所述的溶液P1中SDS的浓度为1％-5％，优选1％-3％。本专利技术的第六优先技术方案为，所述的溶液P1的的pH为11-13，优选12-13。本专利技术的第七优先技术方案为，所述的溶液P2的加入量为5-10ul，优选5-8ul。本专利技术的第八优先技术方案为，所述的溶液P2的pH为4.8-5.7，优选5.3-5.7。本专利技术的的第九优选技术方案为，所述的加入溶液P2后离心时间为1-5min，优选1-2min。其中，本专利技术的生物样本选自细菌、病毒、支原体、衣原体感染的拭子、宫颈刷和液基细胞样本。本专利技术的技术优势为：1.本专利技术操作简单，时间短。传统方法中需用溶菌酶裂解细胞，蛋白酶K来去除样本中的蛋白质，这个过程需耗时1-2小时，再进行柱纯化DNA，离心步骤多。本专利技术的方法操作简单，采用碱溶液来裂解样本，使细胞膜破裂，细胞中蛋白与十二烷基磺酸钠(SDS)结合，SDS中钠离子与钾离子置换后生成不溶于水的十二烷基磺酸钾(PDS)，从而达到分离核酸的目的。整个提取过程仅为8-10min，大大缩短了所需时间。2.本专利技术操作步骤少且在同一EP管中即可完成整个提取过程，避免了操作过程中因样本转移导致的交叉污染现象，提高了检测结果的准确性。3.本专利技术中使用的碱裂解法不仅用于提取细菌中DNA，还可用于提取病毒、支原体、衣原体中的DNA。4.本专利技术使用Chelex-100结合NaOH，能充分裂解细胞。Chelex-100本身碱性较强，能帮助NaOH更好的裂解细胞，且Chelex-100可以螯合一些对扩增反应有抑制作用的因子(如重金属离子)，提高了PCR扩增的效率。附图说明图1为具体实施方式中两种不同提取方法所提取DNA的荧光定量PCR检测结果。其中1为1号样本用宝生物的广谱型基因组DNA小量纯化试剂盒提取的DNA检测结果；2为1号样本用本专利技术方法提取的DNA检测结果；3为2号样本用宝生物的广谱型基因组DNA小量纯化试剂盒提取的DNA检测结果；4为2号样本用本专利技术方法提取的DNA检测结果；5为3号样本用宝生物的广谱型基因组DNA小量纯化试剂盒提取的DNA检测结果；6为3号样本用本专利技术方法提取的DNA检测结果。图2为具体实施方式中两种不同提取方法所提取DNA的普通PCR产物电泳结果。其中加样孔1：1号样本PCR产物经本专利技术方法浓缩后产物；加样孔2：2号样本PCR产物经本专利技术方法浓缩后产物；加样孔3：3号样本PCR产物经本专利技术方法浓缩后产物；加样孔4：1号样本PCR产物经天根普通DNA产物纯化试剂盒浓缩后产物；加样孔5：2号样本PCR产物经天根普通DNA产物纯化试剂盒浓缩后产物；加样孔6：DL2000DNAMaker；加样孔7：3号样本PCR产物经天根普通DNA产物纯化试剂盒浓缩后产物。图3为具体实施方式中本专利技术方法提取的DNA测序图谱。图4为具体实施方式中宝生物的广谱型基因组DNA小量纯化试剂盒提取的DNA测序图谱。具体实施方式1.用宝生物的广谱型基因组DNA小量纯化试剂盒和本专利技术方法提取解脲脲原体感染的尿道分泌物中的DNA，分别用这两种抽提方法同时提取3个样本，平行比较。1.1用宝生物的广谱型基因组DNA小量纯化试剂盒抽提尿道分泌物中的DNA。1.1.1取200ul含尿道管分泌物的细胞保存液，加入400ul缓冲液GA。1.1.2加入180ul的BufferGL和20ulProteinaseK溶液，旋涡10sec混匀，56℃放置10min。1.1.3加入200ul缓冲液GB和200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。1.1.4将上一步所得溶液都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(≈13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于临床样本PCR检测的快速核酸提取方法，其特征在于，所使用的试剂包含溶液P1和溶液P2。

【技术特征摘要】
1.一种用于临床样本PCR检测的快速核酸提取方法，其特征在于，所使用的试剂包含溶液P1和溶液P2。2.一种用于临床样本PCR检测的快速核酸提取方法，其特征在于，所述的溶液P1含有Chelex-100、NaOH、SDS。3.一种用于临床样本PCR检测的快速核酸提取方法，其特征在于，所述的溶液P2成分是醋酸钾缓冲液。4.一种用于临床样本PCR检测的快速核酸提取方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：(1)取少量生物样本，所述生物样本选自细菌、病毒、支原体、衣原体感染的拭子、宫颈刷和液基细胞样本。(2)取0.5ml样本倒入1.5mlEP管中，12000rmp离心2min。(3)小心弃上清，加入1ml生理盐水，旋涡振荡器上振荡打散沉淀(必要时用枪头轻轻打散沉淀)，12000rpm离心2-5min。(4)小心弃上清，加入50-80ul含5％-10％Chelex-100、0.2-0.4MNaOH、1％-5％SDS、pH＝11-13的溶液P1重悬细胞。注意：用移液枪温柔吹散沉...

【专利技术属性】
技术研发人员：卿志荣，田青，
申请(专利权)人：江苏睿玻生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32