免疫力形成制造技术

一种制备药物的改善的方法，该方法包括使用昆虫的组织、幼虫形式或衍生物，该昆虫已经饲喂含有病原体的食物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】免疫力形成
本专利技术涉及免疫力形成。在英国专利说明书号2368016中，描述了一种制备药物的方法，该方法包括使用昆虫的组织、幼虫形式或衍生物，该昆虫已经饲喂含有病原体的食物。以下将该方法称为“所定义的方法”，并导致以下称为AMP的抗微生物肽的表达。本专利技术的目的是提供所定义的方法的改善。
技术实现思路
根据本专利技术的第一方面，提供了所定义的方法，所述方法通过选择性地改变所使用的病原体的数量或性质来调节(最大化)AMP的表达。当应用于用细菌喂养幼虫，已经发现用不同剂量的细菌最大程度地刺激不同的AMP。因此，有利于高剂量的双翅杀菌肽(Diptericin)的表达和低剂量的麻蝇防卫素(Sapecin)的表达。迄今为止发现的最佳细菌/幼虫组合是由丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)刺激的丝光绿蝇，丁香假单胞菌是对人类或其他动物不致病的并且在环境中发现的细菌。因此，根据本专利技术的第二方面，提供了所定义的方法，所述方法包括通过丁香假单胞菌刺激丝光绿蝇(Luciliasericata)。已发现暴露于该细菌12小时的4日龄的幼虫，与未受刺激的幼虫相比，AMP表达增加至30倍。可以用活的或死的细菌刺激幼虫，而不会影响幼虫饲料消耗或最终重量。附图说明图1显示被饲喂含有黄豆、未受刺激的幼虫(未受刺激的)或受刺激的幼虫(受刺激的)的饮食的小鸡盲肠中的弯曲杆菌的数目。条形图指示组间显著差异。图2显示被饲喂含有黄豆、未受刺激的幼虫(未受刺激的)或受刺激的幼虫(受刺激的)的饮食的小鸡盲肠中的乳酸菌的数目。组间未见显著差异。图3显示被饲喂含有黄豆、未受刺激的幼虫(未受刺激的)或受刺激的幼虫(受刺激的)的饮食的小鸡盲肠中的肠道菌的数目。组间未见显著差异。图4显示被饲喂对照或未受刺激的幼虫或受刺激的幼虫饮食的小鸡盲肠扁桃体中没食子酸甲酯11表达的中位水平。星号表示使用Dunn's事后检测的显着差异。具体实施方式1日龄的Ross肉仔鸡被安置在生物安全设施中，并且饲喂市售的小鸡面包屑，其中含有10％的黄豆粉、粉碎的未受刺激的绿蝇幼虫，或粉碎的未受刺激的绿蝇幼虫。从该培养基中取出在奶粉/蔗糖/小麦胚芽/琼脂混合物中饲养4天的昆虫幼虫并洗涤。然后将它们引入新鲜的生长培养基中，该生长培养基中未添加细菌(未受刺激的)或含有每克约5×107丁香假单胞菌(受刺激的)。在该培养基上培养24小时后，除去幼虫，洗涤以除去所有痕量的生长培养基并冷冻干燥。一旦干燥，就用研杵和研钵粉碎，得到粗粉，添加到小鸡面包屑中。三日龄时，用105cfu空肠弯曲杆菌菌株M1口服感染小鸡。八日龄时，将小鸡安乐死，并通过连续稀释并分别在mCCDA、MRS和VRBG琼脂上铺板，去除了盲肠并检验弯曲杆菌、乳酸菌和肠道菌。使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验分析了小鸡中发现的细菌水平的差异，P<0.05的Dunn's事后检测被认为是显着的。含有受刺激的幼虫的饲料的使用导致盲肠中弯曲杆菌的减少(图1)；在乳酸菌或肠道菌的数目上没有影响(图2和图3)。在定殖方面，8天后，13％的黄豆饲喂的小鸡对盲肠弯曲杆菌呈阴性，18％的未受刺激的幼虫饲喂的小鸡以及41％的受刺激的幼虫饲喂的小鸡对盲肠弯曲杆菌呈阴性。与含黄豆的对照相比，含有受刺激的幼虫的饲料导致有盲肠弯曲杆菌定殖的小鸡的数目显著减少(P<0.05)。在三种不同种类的细菌刺激后，评估了丝光绿蝇、红头丽蝇(Calliphoravacciniae)和家蝇(Muscadomestica)的幼虫的抗微生物肽(AMP)的表达。由于细菌刺激可增加AMP表达，已经进行了实验以研究刺激幼虫的最佳参数。已发现的最佳细菌/幼虫组合是由丁香假单胞菌刺激的丝光绿蝇，丁香假单胞菌是对动物或人类不致病的。已发现暴露于该细菌12小时的4日龄的幼虫，与未受刺激的幼虫相比，AMP表达增加至30倍。可以用活的或死的细菌刺激幼虫，并且该剂量不会影响幼虫饲料消耗或最终重量。还有证据表明细菌的致病性、时间和剂量之间的相互作用影响AMP表达。使用受丁香假单胞菌刺激的丝光绿蝇幼虫制备的粉末进行体外实验，测试其作为空肠弯曲杆菌的抗菌剂的有效性，其中将来自未受刺激的幼虫的粉末用作对照。经3小时的时间，用未受刺激的幼虫的粉末孵育的弯曲杆菌能够生长，而暴露于1％w/v受丁香假单胞菌刺激的幼虫的粉末的细菌培养物显示出显著的细菌死亡(P＝0.0015)。将用丁香假单胞菌激发的丝光绿蝇幼虫饲喂给肉仔鸡。然后将小鸡进行口服感染以测试其免疫力。允许成年的丝光绿蝇在用琼脂固化的小麦胚芽、酵母和奶粉的1:1:1混合物中产卵。将含有卵的混合物分成几部分，并且将幼虫用丁香假单胞菌激发或未经激发进行孵化。4天后，收获幼虫，洗涤以除去饲料并冷冻干燥至含水量为15％。然后将幼虫在冷冻的研杵和研钵中研磨成细粉。18日龄的Ross肉仔鸡的组被安置在生物安全设施中，并且饲喂市售的小鸡面包屑，其中含有10％w/w的黄豆粉(以与饲喂含有幼虫的组的蛋白质水平相等)、10％w/w粉碎的未受刺激的绿蝇幼虫，或10％w/w粉碎的受刺激的绿蝇幼虫。3日龄时，用105cfu空肠弯曲杆菌菌株M1口服感染小鸡。8日龄时，将小鸡安乐死，并将盲肠扁桃体立即置于RNAlater中。使用Qiagen试剂盒提取mRNA，并使用具有鸡β肌动蛋白作为管家基因的引物D11Fcagaattgcagaaagccaca和D11Rttctacgtgtgcgtgtgtga通过定量RT-PCR检验没食子酸甲酯11的表达。没食子酸甲酯11的表达是相对于β肌动蛋白表达而言的。使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验，用Dunn's事后检测来检验小鸡组间的差异，因为数据不是正态分布的。试验结果示于附图的图4中。图A是一个箱线图，其中每个框代表第一到第三个四分位数，中位数用框中的线表示。须线显示数据范围。图B是显示表达的中位数水平的直方图。选择了没食子酸甲酯11，因为其在肠中表达已经被其他人所示出(洪(Hong)等人，家禽科学(Poult.Sci.)(2012)1082)。饮食对没食子酸甲酯11的表达有显著影响(P＝0.0007)。在饲喂含有受刺激的幼虫的饮食的小鸡中，盲肠中的没食子酸甲酯11的表达的相对水平显著高于其在饲喂含有未受刺激的幼虫的饮食的小鸡中的表达。这表明饲喂含有较高量昆虫AMP的受刺激的幼虫刺激宿主AMP表达。这将在饲料本身中蝇AMP的提供的基础上增加肠中抗菌活性的刺激。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备药物的方法，该方法包括使用昆虫的组织、幼虫形式或衍生物，该昆虫已经饲喂含有病原体的食物，该方法特征在于通过选择性地改变使用的病原体的数量或性质来调节(最大化)抗微生物肽的表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.19 GB 1420515.7;2015.11.05 GB 1519523.31.一种制备药物的方法，该方法包括使用昆虫的组织、幼虫形式或衍生物，该昆虫已经饲喂含有病原体的食物...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯多夫·杰里米·伦纳德，
申请(专利权)人：英国大型生物免疫技术有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB