十面体纳米银探针在利用表面等离子共振成像技术筛选核酸适配体中的应用制造技术

本发明专利技术公开了十面体纳米银探针在利用表面等离子共振成像技术筛选核酸适配体中的应用，所述的十面体纳米银探针为：以50～60nm的十面体纳米银为内核，纳米银的外表面有两条核苷酸链，A链为文库反向引物互补链，所述文库反向引物互补链键合在纳米银的外表面；B链为核酸文库序列，所述核酸文库序列与文库反向引物互补链互补配对结合；其中，所述文库反向引物互补链为的结构如下：3’端为文库反向引物互补序列，中间为10个A碱基作为间隔臂，5’端为巯基修饰。本发明专利技术提供的十面体纳米银可以负载核酸文库，能提适配体筛选过程中信号灵敏度，进而提高适配体的筛选效率。

【技术实现步骤摘要】
十面体纳米银探针在利用表面等离子共振成像技术筛选核酸适配体中的应用
本专利技术属于生物监测
，具体涉及一种适配体修饰的纳米银对SPRI信号放大技术及其在乳铁蛋白实时筛选中的应用。
技术介绍
相比纳米金，纳米银具有优良的光化学性质，它能够产生更强和更窄的等离子共振峰。因此，纳米银表面的局域等离子体能够更好的与表面等离子共振(SPR)芯片表面的等离子波进行耦合，产生更强的信号输出。表面等离子共振成像(surfaceplasmonresnonace-imaging)是一种具有对样品无需标记、实时、高通量的光学检测仪器。能够对芯片表面多个靶标样品进行实时定量测定。因此可以通过将筛选靶标负载到芯片表面，通入核酸文库，能够对正筛/负筛靶标进行实时采集，观察适配体筛选过程中正筛/负筛通道文库的结合情况，从而筛选出高亲和、高特异性的核酸适配体。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种十面体纳米银探针用于对SPRI进行信号放大，有利于观察适配体筛选过程中正筛/负筛通道文库的结合情况，从而筛选出高亲和、高特异性的核酸适配体。本专利技术还要解决的技术问题是，提供上述十面体纳米银探针的制备方法。本专利技术还要解决的技术问题是，提供一种用于筛选乳铁蛋白核酸适配体的十面体纳米银探针。本专利技术还要解决的技术问题是，提供上述用于筛选乳铁蛋白核酸适配体的十面体纳米银探针的制备方法。本专利技术最后要解决的技术问题是，提供上述十面体纳米银探针在筛选乳铁蛋白核酸适配体中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：十面体纳米银探针在利用表面等离子共振成像技术筛选核酸适配体中的应用。十面体纳米银表面的局域等离子体能够与传感芯片表面的等离子激元进行电磁耦合，能够加强SPRI光源与表面等离子体的耦合作用；因此产生更强的反射光前后的差异性，进而能提升传感的灵敏度。当核酸适配体筛选过程中，在核酸文库上修饰十面体纳米银颗粒，能够增加检测目标的分子量，以及对十面体纳米银颗粒与表面的电磁耦合加强，增加核酸文库的检测灵敏度，进而缩短适配体筛选轮数。其中，所述的十面体纳米银探针为：以50～60nm的十面体纳米银为内核，纳米银的外表面有两条核苷酸链；A链为文库反向引物互补链，所述文库反向引物互补链键合在纳米银的外表面；B链为核酸文库序列，所述核酸文库序列与文库反向引物互补链互补配对结合；其中，所述文库反向引物互补链为的结构如下：3’端为文库反向引物互补序列，中间为10～18个A碱基作为间隔臂，5’端为巯基修饰。3’端为文库反向引物互补序列用于与核酸文库序列互补结合，由于互补链与文库杂交发生于十面体纳米银表面，因此会存在一定的空间位阻作用，将杂交链段与十面体纳米银之间增加10个A碱基，能够降低空间位阻作用，提高杂交效率，5’端为巯基用于与纳米银的外表面键合，互补序列的长度优选10个A碱基。其中，所述的十面体纳米银探针的制备方法如下：(1)十面体纳米银的合成：将柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、L-精氨酸、硝酸银按照摩尔比为(0.1～70):(0.1～10):(0.2～30):(0.2～30)加入到100～300mL去离子水中，然后加入0.1～1M的硼氢化钠水溶液，使硼氢化钠与硝酸银的摩尔比为(1～100)：1，在蓝光灯照射下反应16～72h，得到十面体纳米银溶液；(2)十面体纳米银的修饰：取步骤(1)得到的十面体纳米银溶液，加入文库反向引物互补链、氯化钠，其中，纳米银、文库反向引物互补链、氯化钠的摩尔比为(0.1～10pmol):(0.1～10nmol):(10～200μmol)，滴加吐温-20，吐温-20与纳米银溶液的体积比为(0.001～0.01)：1，混匀，37℃震荡1～5h；(3)将步骤(2)得到的混合体系静置10～24小时，优选24h；(4)离心步骤(3)得到的溶液，取沉淀加入1×PBS缓冲液重悬，重复离心与重悬的步骤2～4次，1×PBS缓冲溶液每次加入体积为沉淀体积0.1～5倍；最后离心得到的沉淀使用1×PBSM缓冲溶液重悬；所述的离心条件为10000～20000rpm条件下离心10～30分钟，优选15000rpm条件下离心15分钟；(5)向步骤(4)得到的混合体系中加入核酸文库溶液，使核酸文库与修饰有反向引物互补链的十面体纳米银的摩尔比为(100～2000)：1，震荡反应10～60min，得到十面体纳米银探针。步骤(1)中，优选将15mL、50mM柠檬酸钠，15mL(6％)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，2.5mL，10mML-精氨酸，10mL，10mM硝酸银加入到175mL去离子水中，然后再加入0.8mL，0.5M的硼氢化钠水溶液。步骤(2)中，优选取1mL合成十面体纳米银(Ag10)溶液，往里加入70μL浓度10μM文库反向引物杂交链和寡核苷酸链，再加入64μL浓度2M氯化钠水溶液，再加入1滴吐温-20。用于筛选乳铁蛋白核酸适配体的十面体纳米银探针，它是以50～60nm的十面体纳米银为内核，纳米银的外表面键合有文库反向引物互补链，所述的文库反向引物互补链与核酸文库序列互补配对，其中，所述文库反向引物互补链为：5’-SH-(CH2)6-AAAAAAAAAAGAAGAGGAGGGAGGT-3’所述核酸文库序列为：5’-GACAGGCAGGACACCGTAAC-N40-CTGCTACCTCCCTCCTCTTC-3’，其中N40表示40个随机碱基。用于筛选乳铁蛋白核酸适配体的十面体纳米银探针的制备方法，包括如下步骤：(1a)十面体纳米银的合成：将柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、L-精氨酸、硝酸银按照摩尔比为(0.1～70):(0.1～10):(0.2～30):(0.2～30)加入到100～300mL去离子水中，然后加入0.1～1M的硼氢化钠水溶液，使硼氢化钠与硝酸银的摩尔比为(1～100)：1，在蓝光灯照射下反应16～72h，得到十面体纳米银溶液；(2a)十面体纳米银的修饰：取步骤(1)得到的十面体纳米银溶液，加入文库反向引物互补链、氯化钠，其中，纳米银、文库反向引物互补链、氯化钠的摩尔比为(0.1～10pmol):(0.1～10nmol):(10～200μmol)，滴加吐温-20，吐温-20与纳米银溶液的体积比为(0.001～0.01)：1，混匀，37℃震荡1～5h；所述文库反向引物互补链为：5’-SH-(CH2)6-AAAAAAAAAAGAAGAGGAGGGAGGT-3’(3a)将步骤(2a)得到的混合体系静置10～24小时；(4a)离心步骤(3a)得到的溶液，取沉淀加入1×PBS缓冲液重悬，重复离心与重悬的步骤2～4次，1×PBS缓冲溶液每次加入体积为沉淀体积0.1～5倍；最后离心得到的沉淀使用1×PBSM缓冲溶液重悬；(5a)向步骤(4a)得到的混合体系中加入核酸文库序列溶液，使核酸文库序列与修饰有反向引物互补链的十面体纳米银的摩尔比为100～2000：1，震荡反应10～60min，得到十面体纳米银探针；所述核酸文库序列为：5’-GACAGGCAGGACACCGTAAC-N40-CTGCTACCTCCCTCCTCTTC-3’，其中N40表示40个随机碱基。步骤(1a)中，柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、L-精氨酸、硝酸银的摩尔比优选为(0.1～70):(0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
十面体纳米银探针在利用表面等离子共振成像技术筛选核酸适配体中的应用。

【技术特征摘要】
1.十面体纳米银探针在利用表面等离子共振成像技术筛选核酸适配体中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的十面体纳米银探针为：以50～60nm的十面体纳米银为内核，纳米银的外表面有两条核苷酸链，A链为文库反向引物互补链，所述文库反向引物互补链键合在纳米银的外表面；B链为核酸文库序列，所述核酸文库序列与文库反向引物互补链互补配对结合；其中，所述文库反向引物互补链为的结构如下：3’端为文库反向引物互补序列，中间为10～18个A碱基作为间隔臂，5’端为巯基修饰。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的十面体纳米银探针的制备方法如下：(1)十面体纳米银的合成：将柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、L-精氨酸、硝酸银按照摩尔比为(0.1～70):(0.1～10):(0.2～30):(0.2～30)加入到100～300mL去离子水中，然后加入0.1～1M的硼氢化钠水溶液，使硼氢化钠与硝酸银的摩尔比为(1～100)：1，在蓝光灯照射下反应16～72h，得到十面体纳米银溶液；(2)十面体纳米银的修饰：取步骤(1)得到的十面体纳米银溶液，加入文库反向引物互补链、氯化钠，其中，纳米银、文库反向引物互补链、氯化钠的摩尔比为(0.1～10pmol):(0.1～10nmol):(10～200μmol)，滴加吐温-20，吐温-20与纳米银溶液的体积比为(0.001～0.01):1，混匀，37℃震荡1～5h；(3)将步骤(2)得到的混合体系静置10～24小时；(4)离心步骤(3)得到的溶液，取沉淀加入1×PBS缓冲液重悬，重复离心与重悬的步骤2～4次，1×PBS缓冲溶液每次加入体积为沉淀体积0.1～5倍；最后离心得到的沉淀使用1×PBSM缓冲溶液重悬；(5)向步骤(4)得到的混合体系中加入核酸文库溶液，使核酸文库与修饰有反向引物互补链的十面体纳米银的摩尔比(100～2000):1，震荡反应10～60min，得到十面体纳米银探针。4.用于筛选乳铁蛋白核酸适配体的十面体纳米银探针，其特征在于，它是以50～60nm的十面体纳米银为内核，纳米银的外表面有两条核苷酸链，A链为文库反向引物互补链，所述文库反向引物互补链键合在纳米银的外表面；B链为核酸文库序列，所述核酸文库序列与文库反向引物互补链互补配对结合；其中，所述文库反向引物互补链为：5’-SH-(CH2)6-AAAAAAAAAAGAAGAGGAGGGAGGT-3’所述核酸文库序列为：5’-GACAGGCAGGACACCGTAAC-N40-CTGCTACCTCCCTCCTCTTC-3’，其中N40表示40个随机碱基。5.权利要求4所述的十面体纳米银探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1a)十面体纳米银的合成：将柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、L-精氨酸、硝酸银按照摩尔比为(0.1～70):(0.1～10):(0.2～30):(0.2～30)加入到100～300mL去离子水中，然后加入0.1～1M的硼氢化钠水溶液，使硼氢化钠与硝酸银的摩尔比为(1～100):1，在蓝光灯照射下反应16～72h，得到十面体纳米银溶液；(2a)十面体纳米银的修饰：取步骤(1)得到的十面体纳米银溶液，加入文库反向引物互补链、氯化钠，其中，纳米银、文库反向引物互补链、氯化钠的摩尔比为(0.1～10pmol):(0.1～10nmol):(10～200...

【专利技术属性】
技术研发人员：许丹科，贾文超，李慧，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32