一种用于瓜类果斑病菌的双标记免疫荧光检测试纸制造技术

本发明专利技术提供了一种用于瓜类果斑病菌的双标记免疫荧光检测试纸，包括一个支撑层、样品垫、吸水垫、硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述的检测线靠近样品垫的一侧，所述的质控线靠近吸水垫的一侧，所述的硝酸纤维素膜靠近样品垫的一侧设置有结合垫，所述的结合垫和所述的样品垫紧密连接，所述的检测线由保藏号为No.10413的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体构成，所述的单克隆抗体的浓度为2mg/mL，所述的结合垫上喷涂有异硫氰酸荧光素标记的由保藏号为No.10413的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。本发明专利技术的荧光检测试纸可检出大多数的果斑病菌且无交叉反应，具有灵敏度高、准确性好等特点。

Double label immunofluorescence detection test paper for melon fruit spot pathogen

The present invention provides a method for double labeling immunofluorescence test of melon fruit blotch, which comprises a support layer, a sample pad and a water absorbing pad, a nitrocellulose membrane, the nitrocellulose membrane is arranged on the test line and control line detection, the near side of the sample pad, one side of the control line close to the absorbent pad, one side of the pyroxylin film near the sample pad is provided with a combination pad, the pad with the sample pad and the connecting line of the detection by the preservation number of monoclonal hybridoma cell lines secreting anti No.10413 body, wherein the concentration of monoclonal antibody 2mg/mL, combined with the pad by spraying monoclonal antibody preserved by hybridoma cell lines for No.10413 secretion are labeled with fluorescein isothiocyanate. The fluorescent test paper of the invention can detect most of the fruit spot pathogens and has no cross reaction, and has the characteristics of high sensitivity and good accuracy.

【技术实现步骤摘要】
一种用于瓜类果斑病菌的双标记免疫荧光检测试纸
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种微生物的检测方法，具体来说是一种用于瓜类果斑病菌的双标记免疫荧光检测试纸。
技术介绍
瓜类果斑病是一种严重的细菌性病害，20世纪80年代后期该病因在美国数个州的西瓜上出现破坏性爆发而受到广泛关注，自此，瓜类细菌性果斑病在世界范围内传播开来。其病原为革兰氏阴性菌的嗜酸菌属燕麦种西瓜亚种(Acidovoraxcitrulli,Ac)，是一种具有高度破坏性的种传病菌。该病菌的抗干旱能力非常强，可在干燥的种子表面存活35年。到目前为止，并无完全抵抗该病菌的商业化的培育品种。瓜类果斑病菌又称果斑病菌，它可以引起西瓜、甜瓜、南瓜等葫芦科植物患病，据报道，在番茄、茄子等茄科植物的种子中也检测到了该病原菌，它可侵染果实、植株及种子，主要依靠带菌种子传播。带菌种子播种后会使幼苗患病，出现褐色坏死斑。带菌果实在采后贮藏运输过程中会感染健康果实，表面会出现水渍状斑点，最终导致整个果实腐烂，严重影响瓜类产量。目前市场上用于检测果斑病菌的试纸是来自美国Agdia公司的免疫胶体金试纸，国内严重依赖进口，且现有技术中的免疫胶体金试纸的检测效果取决于抗体与胶体金的结合效果及金标抗体与检测抗体的配对情况。目前报道的试纸多为单克隆抗体作为金标抗体和多克隆抗体作为检测抗体配合使用，因此存在着检测灵敏度低、交叉反应多、试纸条有效期短等问题，对检测准确度造成了一些不利影响。
技术实现思路
针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种用于瓜类果斑病菌的双标记免疫荧光检测试纸，所述的这种用于瓜类果斑病菌的双标记免疫荧光检测试纸要解决现有技术中检测瓜类果斑病菌的试纸灵敏度低、交叉反应多、试纸条有效期短的技术问题。本专利技术提供了一种用于瓜类果斑病菌的双标记免疫荧光检测试纸，包括一个支撑层，所述的支撑层上设置有样品垫、吸水垫，所述的样品垫和所述的吸水垫之间设置有硝酸纤维素膜，所述的硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述的检测线靠近样品垫的一侧，所述的质控线靠近吸水垫的一侧，所述的硝酸纤维素膜靠近样品垫的一侧设置有结合垫，所述的结合垫和所述的样品垫紧密连接，所述的检测线由保藏号为No.10413的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体构成，所述的单克隆抗体的浓度为2mg/mL，所述的结合垫上喷涂有异硫氰酸荧光素标记的由保藏号为No.10413的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。进一步的，所述的质控线由羊抗鼠IgG抗体构成。进一步的，所述的支撑层为PVC底板。进一步的，所述的吸水垫为吸水纸。本专利技术还提供了采用上述的试纸检测瓜类果斑病菌的方法，将待检测细菌放置于异硫氰酸荧光素改良培养基中过夜培养，所述的异硫氰酸荧光素改良培养基由异硫氰酸荧光素和脑心浸液培养基组成，所述的异硫氰酸荧光素在异硫氰酸荧光素改良培养基中的浓度为20μg/mL，将菌悬液采用无菌生理盐水调到至少105CFU/mL，然后将含有待检测细菌的菌悬液滴加至样品垫上，随着待检测细菌的流动，如果检测线的颜色变为黄色，则表示待检测样品中含有瓜类果斑病菌，若检测线不变色，则代表样品中无瓜类果斑病菌。本专利技术采用添加FITC的改良脑心浸液(BHI)培养基培养细菌，该方式培养的细菌可以发出黄绿色的荧光，可用作荧光探针；由保藏号为CGMCC10413的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体6D作为检测抗体，喷涂于NC膜上形成检测线，同时抗体6D用FITC标记后喷涂于结合垫形成捕捉抗体，该试纸的检测样品与捕捉抗体进行FITC双标记后可起到信号放大的作用。同时仅用一株抗体，试纸的特异性仅与该单抗的性能相关，可保证试纸的特异性。本专利技术由于同时采用了细菌与抗体双标记后作为荧光探针，起到了信号放大的作用，使得检测灵敏度较高。由于选用6D分泌的抗体既作为检测抗体又作为捕捉抗体，因而试纸的交叉反应仅与该单抗的特异性相关，实验结果表明该免疫荧光试纸对果斑病菌的检测特异性、准确度及灵敏度均较高。本专利技术的一种杂交瘤细胞株，分类命名：抗瓜类细菌性果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrullii)杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院(中科院微生物研究所)，保藏日期为2015年3月19日，保藏号为CGMCCNo.10413。本专利技术采用的保藏号为No.10413的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体的全部内容在2015年10月21日公开的申请号为“201510420442.6”、专利技术名称为“果斑病菌免疫胶体金检测试纸条及其单抗和杂交瘤细胞株”/2016年07月20日公开的申请号为“201610270079.9”、专利技术名称为“果斑病菌单抗及其杂交瘤细胞株”的文件中均有记载，在此不再赘述。本专利技术和已有技术相比，其技术进步是显著的。本专利技术通过添加FITC改良了培养基，以此培养基培养的细菌可以发出黄绿色的荧光，从而使细菌成为荧光探针。抗果斑病菌的单克隆抗体6D作为检测抗体并用FITC标记后作为捕捉抗体，制成双荧光标记的免疫荧光试纸。实验表明此荧光检测试纸可检出大多数的果斑病菌且无交叉反应，具有灵敏度高、准确性好等特点。附图说明图1是本专利技术实施例中果斑病菌的免疫荧光检测试纸的改良培养基培养细菌后的荧光显微镜观察结果；图2是本专利技术实施例中果斑病菌的免疫荧光检测试纸的流式细胞仪检测不同FITC浓度细菌荧光强度结果；图3是本专利技术实施例中果斑病菌的免疫荧光检测试纸的结构示意图；图4是本专利技术实施例中果斑病菌的免疫荧光检测试纸的特异性反应结果；图5是本专利技术实施例中果斑病菌的免疫荧光检测试纸的灵敏度结果；图6是本专利技术实施例中果斑病菌的免疫荧光检测试纸的实际样品的检测结果；图7是本专利技术实施例中果斑病菌的免疫荧光检测试纸的实际样品的PCR检测结果。具体实施方式以下结合附图介绍本专利技术的具体实施方式：首先介绍本专利技术实施例中所使用的试剂与仪器：主要试剂：BSA上海世泽生物科技有限公司；FITC美国SIGMA公司；硝酸纤维素膜(NC膜)美国Millipore公司；脑心浸液培养基北京陆桥有限公司。主要仪器：酶标仪SpectraMaxM2，购自MolecularDevices；Nanodrop2000C购自ThermoScientific；点样仪AD6010购自BIO-DOT；恒温培养摇床SPH-100B购自上海世平；单人净化工作台SW-SJ-2D购自苏州净化。本实验用的果斑病菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株6D4C5E9B9于2015年4月保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，中国，北京市)，保藏号为中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，中国，北京市)No.10413。本实验用的8株果斑病菌及测定交叉反应的其余植物病原菌均由中国检验检疫科学研究院惠赠，已经进行了分离鉴定及柯赫氏法则等的验证。实施例1免疫荧光检测试纸的研制1.异硫氰酸荧光素(FITC)改良培养基新鲜配置FITC母液，取不同体积FITC溶液添加到脑心浸液培养基(BHI)中制成改良的BHI培养基，接种果斑病菌后37℃避光培养12h。图1为改良的BHI培养基培养的细菌在荧光显微镜下观察结果，可见该方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于瓜类果斑病菌的双标记免疫荧光检测试纸，包括一个支撑层，所述的支撑层上设置有样品垫、吸水垫，所述的样品垫和所述的吸水垫之间设置有硝酸纤维素膜，所述的硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述的检测线靠近样品垫的一侧，所述的质控线靠近吸水垫的一侧，其特征在于：所述的硝酸纤维素膜靠近样品垫的一侧设置有结合垫，所述的结合垫和所述的样品垫紧密连接，所述的检测线由保藏号为No.10413的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体构成，所述的单克隆抗体的浓度为2mg/mL，所述的结合垫上喷涂有异硫氰酸荧光素标记的由保藏号为No.10413的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种用于瓜类果斑病菌的双标记免疫荧光检测试纸，包括一个支撑层，所述的支撑层上设置有样品垫、吸水垫，所述的样品垫和所述的吸水垫之间设置有硝酸纤维素膜，所述的硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述的检测线靠近样品垫的一侧，所述的质控线靠近吸水垫的一侧，其特征在于：所述的硝酸纤维素膜靠近样品垫的一侧设置有结合垫，所述的结合垫和所述的样品垫紧密连接，所述的检测线由保藏号为No.10413的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体构成，所述的单克隆抗体的浓度为2mg/mL，所述的结合垫上喷涂有异硫氰酸荧光素标记的由保藏号为No.10413的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的一种用于瓜类果斑病菌的双标记免疫荧光检测试纸，其特征在于：所述的质控线由羊抗鼠IgG抗体构成。3.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾海娟，刘箐，谢曼曼，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：上海,31