结合EGFR和C‑MET III型纤连蛋白域的分子制造技术

本发明专利技术公开了包含EGFR和/或c‑Met FN3域的单特异性和双特异性分子、编码所述分子的分离的多核苷酸、载体、宿主细胞，以及它们的制备方法。这些包含EGFR和/或c‑Met FN3域的单特异性和双特异性分子可用于生成用于治疗和诊断包括癌症的病症和疾病的治疗组合物。

The combination of EGFR and C MET III domain of fibronectin molecules

The present invention discloses containing EGFR and / or C Met FN3 single domain specific and bispecific molecules, encoding the molecule isolated polynucleotides, vectors, host cells, and methods for their preparation. These include EGFR and / or C Met FN3 single domain specificity and bispecific molecules can be used to generate therapeutic compositions for the diagnosis and treatment of diseases and diseases including cancer.

【技术实现步骤摘要】
结合EGFR和C-METIII型纤连蛋白域的分子本申请是申请日为2013年11月21日，申请号为201380071078.6，专利技术名称为“结合EGFR和C-METIII型纤连蛋白域的分子”的专利技术专利的分案申请。
本专利技术涉及结合EGFR和/或c-Met的单特异性或双特异性分子以及制备和使用该分子的方法。
技术介绍
表皮生长因子受体(EGFR、ErbB1或HER1)是由c-erbB1原癌基因编码的170kDa跨膜糖蛋白。EGFR是受体酪氨酸激酶(RTK)的人表皮生长因子受体(HER)家族的成员，所述家族包括HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)。EGFR信号传导通过如下方式引发：配体结合、之后诱导构象变化、受体与其他ErbB家族成员的同源二聚化或异源二聚化，以及受体的反式自磷酸化(Ferguson等人，AnnuRevBiophys，37：353-73，2008)，这引发了信号转导级联，最终影响多种多样的细胞功能，包括细胞增殖和存活。EGFR的表达或激酶活性的增加与一系列人癌症有关，从而使EGFR成为治疗干预的有吸引力的靶标(Mendelsohn等人，Oncogene19：6550-6565，2000；Grünwald等人，JNatlCancerInst，95：851-67，2003；Mendelsohn等人，SeminOncol，33：369-85，2006)。在非小细胞肺癌中，EGFR基因拷贝数和蛋白表达两者的增加与对EGFR酪氨酸激酶抑制剂IRESSATM((吉非替尼)的有利响应相关联(Hirsch等人，AnnOncol18：752-60，2007)。EGFR疗法包括小分子和抗EGFR抗体两者，它们经批准用于治疗结肠直肠癌、胰腺癌、头颈癌和非小细胞肺癌(NSCLC)(Baselga和Arteaga，JClinOncol，23：2445-2459(20005；Gill等人，JBiolChem，259：7755-7760，1984；Goldstein等人，ClinCancerRes，1：1311-1318，1995；Prewett等人，ClinCancerRes，4：2957-2966，1998)。抗EGFR疗法的疗效可取决于瘤类型以及瘤中的EFGR突变/扩增状态。当前疗法的副作用可包括皮肤毒性(DeRoock等人，LancetOncol11：753-762，2010；Linardou等人，NatRevClinOncol，6：352-366，2009；Li和Perez-Soler，TargOncol4：107-119，2009)。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)通常用作非小细胞肺癌(NSCLC)的二线疗法，但由于抗药途径的原因，通常会在十二个月内失效(Riely等人，C1inCancerRes12：839-44，2006)。c-Met编码酪氨酸激酶受体。其在1984年在发现用致癌物处理产生了组成型活性融合蛋白TPR-MET之后，首次被鉴定为原癌基因(Cooper等人，Nature，311：29-33，1984)。c-Met被其配体肝细胞生长因子(HGF)激活会刺激大量的细胞过程，包括生长、运动、侵袭、转移、上皮细胞-细胞转化、血管生成/创伤愈合以及组织再生(Christensen等人，CancerLett225：1-26，2005；Peters和Adjei，NatRevClinOncol，9：314-26，2012)。c-Met被合成为单链蛋白质，该蛋白质被蛋白水解裂解成由二硫键连接的50kDaα-亚基和140kDaβ-亚基(Ma等人，CancerandMetastasisReviews，22：309-325，2003)。c-Met在结构上类似于其他膜受体诸如Ron和。HGF：c-Met结合的准确化学计量尚不清楚，但通常认为两个HGF分子结合于两个c-Met分子，导致受体二聚化以及在1230、1234和1235位酪氨酸处自磷酸化(Stamos等人，TheEMBOJournal，23：2325-2335，2004)。非配体依赖性c-Met自磷酸化也可由于基因扩增、突变或受体过表达而发生。c-Met在多种类型的癌(包括胃癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、胰腺癌和CNS癌)中常常被扩增、突变或过表达。通常定位于激酶域的错义突变常见于遗传性乳头状肾细胞癌(PRCC)和13％的散发性PRCC(Schmidt等人，Oncogene18：2343-2350，1999)。定位于c-Met的臂板蛋白或近膜域的c-Met突变常见于胃癌、头颈癌、肝癌、卵巢癌、NSCLC和甲状腺癌(Ma等人，CancerandMetastasisReviews，22：309-325，2003；Sakakura等人，ChromosomesandCancer，1999，24：299-305)。已在脑癌、结肠直肠癌、胃癌和肺癌中检测到c-Met扩增，这通常与疾病进展相关(Ma等人，CancerandMetastasisReviews，22：309-325，2003)。分别多至4％和20％的非小细胞肺癌(NSCLC)和胃癌表现出c-Met扩增(Sakakura等人，ChromosomesandCancer，1999，24：299-305；Sierra和Tsao，TherapeuticAdvancesinMedicalOncology，3：S21-35，2011)。甚至在不存在基因扩增的情况下，通常在肺癌中观察到c-Met过表达(Ichimura等人，JpnJCancerRes，87：1063-9，1996)。此外，在临床样品中，将近一半的肺腺癌表现出高水平的c-Met和HGF，这两者均与增强的瘤生长速率、转移和不良预后相关(Sierra和Tsao，TherapeuticAdvancesinMedicalOncology，3：S21-35，2011；Siegfried等人，AnnThoracSurg66：1915-8，1998)。抵抗EGFR酪氨酸激酶抑制剂的所有瘤中的将近60％增加c-Met表达、扩增c-Met或增加其唯一已知配体HGF(Turke等人，CancerCell，17：77-88，2010)，表明存在通过c-Met对EGFR的补偿途径。在抵抗吉非替尼(一种EGFR激酶抑制剂)并经Her3途径表现出增强存活率的培养细胞中，c-Met扩增被首次鉴定(Engelman等人，Science，316：1039-43，2007)。这进一步在临床样品中得到验证，其中具有对厄洛替尼或吉非替尼的获得性抗性的43名患者中有9名表现出c-Met扩增，与之相比的是，62名未治疗患者中仅两名有此表现。九名治疗患者中有四名也获得了EGFR激活突变T790M，证实为同步抗性途径(Beat等人，ProcNatlAcadSciUSA，104：20932-7，2007)。EGFR和c-Met在癌中的单独作用已充分确立，使得这些靶标对于联合疗法具有吸引力。两个受体均通过相同的存活和抗凋亡途径(ERK和AKT)传导信号；因此，联合抑制该对受体可限制补偿途径激活的可能性，从而改善总体疗效。在(厄本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的包含FN3域的双特异性分子，其包含第一III型纤连蛋白(FN3)域和第二FN3域，其中所述第一FN3域特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)并阻碍表皮生长因子(EGF)结合于EGFR，并且所述第二FN3域特异性地结合肝细胞生长因子受体(c‑Met)并阻碍肝细胞生长因子(HGF)结合于c‑Met，其中所述第一FN3域包含与SEQ ID NO: 27的氨基酸序列至少87%相同的氨基酸序列，并且所述第二FN3域包含与SEQ ID NO: 41的氨基酸序列至少83%相同的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
2012.11.21 US 61/728906;2012.11.21 US 61/728914;201.一种分离的包含FN3域的双特异性分子，其包含第一III型纤连蛋白(FN3)域和第二FN3域，其中所述第一FN3域特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)并阻碍表皮生长因子(EGF)结合于EGFR，并且所述第二FN3域特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-Met)并阻碍肝细胞生长因子(HGF)结合于c-Met，其中所述第一FN3域包含与SEQIDNO:27的氨基酸序列至少87%相同的氨基酸序列，并且所述第二FN3域包含与SEQIDNO:41的氨基酸序列至少83%相同的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的双特异性分子，其中a)当在A431细胞中使用50ng/mL人EGF测量时，所述第一FN3域以小于约2.5×10-6M的IC50值抑制在EGFR残基第1173位酪氨酸处EGF诱导的EGFR磷酸化，并且当在NCI-H441细胞中使用100ng/mL人HGF测量时，所述第二FN3域以小于约1.5×10-6M的IC50值抑制在c-Met残基第1349位酪氨酸处HGF诱导的c-Met磷酸化；b)当在A431细胞中使用50ng/mL人EGF测量时，所述第一FN3域以约1.8×10-8M和约2.5×10-6M之间的IC50值抑制在EGFR残基第1173位酪氨酸处EGF诱导的EGFR磷酸化，并且当在NCI-H441细胞中使用100ng/mL人HGF测量时，所述第二FN3域以约4×10-9M和约1.5×10-6M之间的IC50值抑制在c-Met残基第1349位酪氨酸处HGF诱导的c-Met磷酸化；c)所述第一FN3域以小于约1×10-8M的离解常数(KD)结合人EGFR，并且所述第二FN3域以小于约5×10-8M的KD结合人c-Met，其中所述KD利用实例3中所述的表面等离子共振来测量；或d)所述第一FN3域以约2×10-10至约1×10-8M的KD结合人EGFR，并且所述第二FN3域以约3×10-10至约5×10-8M的KD结合人c-Met，其中所述KD利用实例5中所述的表面等离子共振来测量。3.根据权利要求1或2所述的双特异性分子，其中所述双特异性分子以与所述第一FN3域和所述第二FN3域的混合物对NCI-H292细胞生长的抑制的IC50值相比小至少30倍的IC50值抑制NCI-H292细胞增殖，其中用包含7.5ng/mL的HGF的10%的FBS诱导所述细胞增殖。4.根据权利要求1-3中任一项所述的双特异性分子，其中所述双特异性分子a)当在NCI-H292细胞中使用50ng/mL人EGF测量时，以小于约8×10-7M的IC50值抑制EGFR残基第1173位酪氨酸处EGF诱导的EGFR磷酸化；b)当在NCI-H441细胞中使用100ng/mL人HGF测量时，以小于约8.4×10-7M的IC50值抑制在c-Met残基第1349位酪氨酸处HGF诱导的c-Met磷酸化；c)以小于约9.5×10-6M的IC50值抑制HGF诱导的NCI-H292细胞增殖，其中用包含7.5ngHGF的10%FBS诱导所述细胞增殖；d)以小于约2.0×10-8M的KD结合EGFR；或e)以小于约2.0×10-8M的KD结合c-Met，其中所述KD利用如实例3和实例5所述的表面等离子共振来测量。5.根据权利要求1-4中任一项所述的双特异性分子，其中所述第一FN3域包含SEQIDNO:107或SEQIDNO:108的氨基酸序列，并且所述第二FN3域包含SEQIDNO:114的氨基酸序列。6.根据权利要求1-5中任一项所述的双特异性分子，其中所述第一FN3域以对应于P54AR4-83v2(SEQIDNO:27)的残基D23、F27、Y28、V77和G85的一个或多个氨基酸残基结合EGFR。7.根据权利要求6所述的双特异性分子，其中所述第二FN3域以对应于P114AR7P95-A3(SEQIDNO:41)中的残基R34、F38、M72和I79的一个或多个氨基酸残基结合c-Met。8.根据权利要求1-7中任一项所述的双特异性分子，其中a)所述第一FN3域包含：i)FG环，所述FG环包含SEQIDNO:179的氨基酸序列或SEQIDNO:180的氨基酸序列；和ii)BC环，所述BC环包含SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：M安德森，R阿特塔，M迪伊姆，L原，S贾科布斯，A金，D克莱恩，S莫雷斯，K奥内尔，K皮查，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国,US