本发明专利技术公开了一种如式(I)所示以萘酰亚胺为母核的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针及其制备与应用，其制备方法为将式(Ⅱ)所示化合物在哌啶与硝基甲烷存在下，在无水乙醇中25‑80℃下反应8‑12h，反应液分离纯化，获得所述式(I)所示的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针，所述式(I)化合物可用作识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针并应用于检测半胱氨酸和同型半胱氨酸浓度中。
Identification of cysteine and homocysteine fluorescent probe using naphthalene imide as parent nucleus, preparation and application thereof
The invention discloses a formula (I) shown in the synthesis and application of nucleus identification of cysteine and homocysteine with fluorescent probe and naphthalimide, the preparation method of formula (II) compounds in the presence of piperidine and nitromethane, in anhydrous ethanol 25 80 C under the 8 reaction 12h, reaction liquid separation and purification, to obtain the formula (I) shown in the identification of cysteine and homocysteine fluorescence probe, the formula (I) compounds can be used as identification of cysteine and homocysteine fluorescence probe based on the detection of cysteine and homocysteine concentration.
【技术实现步骤摘要】
一种以萘酰亚胺为母核的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针及其制备与应用
本专利技术涉及一种检测细胞内外源半胱氨酸、同型半胱氨酸荧光探针，具体涉及以1,8-萘酰亚胺为母核的新型荧光探针的制备方法及应用。
技术介绍
小分子硫醇在保持细胞内环境的氧化还原环境以及阻止活性氧簇过量表达从而导致的细胞损伤起到很关键的作用。细胞内的小分子生物巯醇，包括谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、半胱氨酸(Cysteine，Cys)以及同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)。其中半胱氨酸作为谷胱甘肽、辅酶A的重要组成部分，非正常的半胱氨酸浓度会导致组织或细胞损害，导致许多疾病的产生，例如肝损伤、老年痴呆症、帕金森综合症等等。而同型半胱氨酸作为心血管疾病和阿尔茨海默氏症等疾病的重要指标，受到广大研究人员的重视。由于荧光探针具有高效、安全、活体实时检测的优点，在近几年中有许多文献报道利用荧光探针检测细胞内外源的小分子生物硫醇。萘酰亚胺作为一种双光子染料，具有较大的量子产率以及较长的斯托克斯位移，深受广大研究人员喜爱，经过对萘酰亚胺3、4位的修饰，可用于检测各种活性小分子以及细胞内的蛋白质等等。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种以1,8-萘酰亚胺为母核的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针及其制备方法与用途，其中检测活性位点为硝基烯烃。本专利技术采用的技术方案是：一种如式(I)所示的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针，其结构式为：本专利技术提供了式(I)所示的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将式(Ⅱ)所示化合物在哌啶与硝基甲烷存在下，在无水乙醇中25-80℃下反应8-12h，反应液分离纯化，获得所述式(I)所示的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针。式(Ⅱ)所示化合物反应生成式(I)所示化合物的反应路线如下：进一步，本专利技术所述式(Ⅱ)所示化合物与硝基甲烷、哌啶的物质的量比为1:1.2-2:1.2-2。更进一步，本专利技术所述反应液分离纯化为：反应液减压旋蒸去除溶剂，取浓缩物进行高效薄层层析分离，以体积比15：1的二氯甲烷甲醇混合液为展开剂，洗脱目标产物，获得式(I)所示的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针。此外，本专利技术所述式(I)所示的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针在检测半胱氨酸和同型半胱氨酸中的应用。所述半胱氨酸为0～2mmol/L半胱氨酸水溶液。进一步，本专利技术所述式(I)所示的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针在检测细胞内半胱氨酸和同型半胱氨酸中的应用。所述半胱氨酸为细胞内0～1mmol/L半胱氨酸水溶液。更进一步，本专利技术所述细胞为肝癌细胞HepG2。本专利技术所述的半胱氨酸浓度的荧光检测的方法为：以化合物(I)作为荧光探针，与PBS缓冲溶液中的半胱氨酸溶液进行反应，生成荧光物质(Ⅲ)，测定在激发波长为480nm下的荧光强度变化，从而获得半胱氨酸浓度。上述反应过程反应式如下：其次，在HepG2细胞内检测半胱氨酸浓度的方法为：在HepG2细胞内加入半胱氨酸或者N-乙基马来酰亚胺进行孵化，一段时间后，加入化合物(I)然后孵化半小时后进行荧光成像，激发波长为488nm，发射波长为520nm到610nm。本专利技术荧光探针的结构中以3号位的取代基的推拉电子能力的改变以及硝基作为一个荧光淬灭基团从而导致荧光的淬灭。当半胱氨酸与化合物(I)反应后，硝基与萘酰亚胺的共轭体系被破坏，荧光恢复，从而达到荧光从关-开的效果。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术选用的1,8-萘酰亚胺结构是个双光子荧光团，具有良好的光稳定性以及很大的斯托克位移。我们合成的化合物(I)以硝基烯烃为活性位点，对半胱氨酸以及同型半胱氨酸具有良好的选择性，而对GSH则无明显反应；反应时间短，最低检测下限为1.5μM，为研究细胞中内源的半胱氨酸的生理作用提供一种有效的研究工具。附图说明图1为本专利技术中探针(I)的核磁氢谱。图2为本专利技术中探针(I)的核磁碳谱。图3为本专利技术中探针(I)在PBS/乙腈混合液(pH＝7.2，v:v＝1:1,探针40μM)中加入25倍当量半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽水溶液下的紫外吸收光谱以及荧光发射光谱图。图4为本专利技术中探针(I)在PBS/乙腈混合液(pH＝7.2，v:v＝1:1,探针10μM)中激发波长为480nm条件下加入不同浓度半胱氨酸水溶液的荧光光谱。图5为本专利技术中探针(I)在PBS/乙腈混合液(pH＝7.2，v:v＝1:1,探针10μM)中激发波长为480nm条件下加入不同氨基酸水溶液的荧光光谱。图6为本专利技术中探针(I)在肝癌细胞(HepG2)中的共聚焦荧光成像效果图，实验分成三组，A组：在37℃、5％CO2条件下，HepG2细胞中加入0.5mM半胱氨酸，培养半小时后用新鲜培养基洗涤，然后加入20μM探针(I)孵化半小时，最后用PBS洗涤三次进行荧光成像。B组：在37℃、5％CO2条件下，HepG2细胞中加入20μM探针(I)孵化半小时，最后用PBS洗涤三次进行荧光成像。C组:在37℃、5％CO2条件下，HepG2细胞中加入2mMN-乙基马来酰亚胺孵化1小时后用新鲜培养基洗涤，随后加入20μM探针(I)培养半小时后，用PBS洗涤三次进行荧光成像。荧光共聚焦显微镜成像激发波长为488nm，发射波长为520-610nm。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此。实施例1探针(I)的合成在25mL圆底烧瓶中分别加入化合物3(0.1g，0.34mmol)、硝基甲烷(0.024g，0.4mmol)、哌啶(0.034g，0.4mmol)、8mL无水乙醇，40℃下加热反应12小时，蒸干溶剂，用薄层层析分离纯化，展开剂为二氯甲烷：甲醇＝15:1，得到产物为0.03g，产率为27％。核磁氢谱见图1，核磁碳谱见图2。1HNMR(500MHz,DMSO)δ8.67(d,J＝12.6Hz,1H),8.49(d,J＝7.8Hz,1H),8.30(d,J＝7.4Hz,2H),8.11(d,J＝12.6Hz,1H),7.48(t,J＝7.6Hz,1H),4.00(t,J＝7.3Hz,2H),1.57(m,2H),1.33(m,2H),0.92(t,J＝7.3Hz,3H).13CNMR(126MHz,DMSO)δ177.54,164.03,162.68,140.93,140.30,132.11,131.65,131.37,130.73,128.92,123.09,121.15,113.74,102.42,38.74,29.94,19.86,13.76.实施例2探针(I)的合成在25mL圆底烧瓶中分别加入化合物3(0.1g，0.34mmol)、硝基甲烷(0.041g，0.68mmol)、哌啶(0.058g，0.68mmol)、8mL无水乙醇，80℃下加热反应8小时，蒸干溶剂，用薄层层析分离纯化，展开剂为二氯甲烷：甲醇＝15:1，得到产物为0.041g，产率为36.9％。核磁氢谱见图1，核磁碳谱见图2。实施例3探针(I)的合成在25mL圆底烧瓶中分别加入化合物3(0.1g，0.34mmol)、硝基甲烷(0.024g，0.4mmol)、哌啶(0.034g，0.4mmol)、8m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种如式(I)所示的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针，其结构式为：
【技术特征摘要】
1.一种如式(I)所示的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针，其结构式为：2.如权利要求1所述的式(I)所示的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针的制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：将式(Ⅱ)所示化合物在哌啶与硝基甲烷存在下，在无水乙醇中25-80℃下反应8-12h，反应液分离纯化，获得所述式(I)所示的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针。3.如权利要求2所述的式(I)所示的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针的制备方法，其特征在于：所述式(Ⅱ)所示化合物与硝基甲烷、哌啶的物质的量比为1:1.2-2:1.2-2。4.如权利要求2所述的式(I)所示...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱勍，谢振达，朱伸，孙宗国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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