水仙黄条病毒和水仙花叶病毒多重荧光定量RT‑PCR试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种水仙黄条病毒和水仙花叶病毒多重荧光定量RT‑PCR试剂盒及检测方法，用于同时快速检测水仙黄条病毒和水仙花叶病毒。该试剂盒包括：NYSV‑正向引物、NYSV‑反向引物、NYSV‑荧光探针、NMV‑正向引物、NMV‑反向引物、NMV‑荧光探针、随机引物、RT Buffer、RNA酶抑制因子、反转录酶、dNTPs、TaqMan PCR Master Mix、阳性对照、阴性对照和RNase‑free ddH

【技术实现步骤摘要】
水仙黄条病毒和水仙花叶病毒多重荧光定量RT-PCR试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种水仙黄条病毒和水仙花叶病毒多重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，属于植物检疫
，适用于进出境口岸检验检疫、农业生产上水仙黄条病毒和水仙花叶病毒的快速检测。
技术介绍
水仙是水仙属（Narcissus）多年生草本植物，在我国栽培历史悠久，是我国传统出口名花。病毒病是水仙上的重要病害，病毒侵染水仙能够引起种球变小、花箭减小、香气变淡、鳞茎退化和植株矮化等症状，造成水仙的产量和品质下降。水仙黄条病毒（NYSV）、水仙花叶病毒（NMV）是水仙生产上发生较为严重的两种病毒。NYSV属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）、马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员，可以通过蚜虫介体以非持久性方式传播，也可以通过汁液传播。NYSV自然寄主主要为石蒜科的水仙和长寿花，摩擦接种可以侵染番杏属植物。NYSV基因组为正义单链RNA，全序列长为9650个核苷酸，病毒粒体呈弯曲线状，粒子大小约755nm×12nm。NYSV在受感染的水仙植株上可引起花叶黄条、球根变小等症状，常常与水仙花叶病毒复合侵染。NYSV几乎分布于欧洲、北美洲、澳洲及亚洲等世界各地的水仙主要栽培区。NMV属于线性病毒科（Flexiviridae）、马铃薯X病毒属（Potexvirus）成员，主要通过汁液接触传播。NMV已报道的自然寄主为水仙。NMV基因组为正义单链RNA，基因组全长为6955个核苷酸，病毒粒体为线条状，粒子大小约550nm×13nm。NMV侵染水仙后，初期引起植株叶片或花梗出现褪绿斑，后期引起花叶逐渐明显，并扩展为较大的斑块，严重时造成叶片扭曲、黄化和植株畸形等症状。NMV主要分布在荷兰、英国和中国等国家。为控制水仙黄条病毒（NYSV）和水仙花叶病毒（NMV）病毒的发生、传播和扩散，保护水仙生产安全，加强NYSV、NMV检测具有极其重要的意义。目前，已报道和应用较多的NYSV、NMV检测方法为血清学ELISA和普通RT-PCR两种方法。血清学ELISA检测方法需要使用昂贵的检测试剂，并且对血清的特异性和纯度要求高，同时其灵敏度与普通RT-PCR相比较低，检测结果易出现假阴性。普通RT-PCR方法仅能用于水仙上NYSV或NMV的单一检测，不能用于同时检测NYSV和NMV两种病毒。如专利号为ZL201210195105.8的中国专利技术专利《用于检测水仙花叶病毒和水仙黄条病毒的试剂盒及其检测方法》，能够单一检测NYSV或NMV，无法一次试验同时检测两种病毒。与血清学ELISA、普通RT-PCR相比，利用多重荧光定量RT-PCR检测NYSV、NMV，不仅可以实现NYSV、NMV单一或复合侵染的检测，而且特异性更强、灵敏度更高。但到目前为止，尚未见专门用于NYSV、NMV同时检测的多重荧光定量RT-PCR检测方法，更未见专门的多重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够用于水仙黄条病毒、水仙花叶病毒单一或复合侵染检测的多重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，克服现有技术中存在的缺陷和不足，能够对进出境口岸及农业生产上水仙黄条病毒、水仙花叶病毒进行快速、准确鉴定，特别是两种病毒的复合侵染鉴定，具有特异性强、灵敏度高和准确性好的显著优点。本专利技术技术方案如下：（一）一种用于水仙黄条病毒和水仙花叶病毒检测的多重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：1）NYSV-正向引物：10μmol/L，引物序列为5’-TGGATGGAGAAGAACAAGTTGAATT-3’；2）NYSV-反向引物：10μmol/L，引物序列为5’-GCCATTATCTGCCTGAGTGTAGGT-3’；3）NYSV-荧光探针：10μmol/L，荧光探针序列为5’-CY5-CCACTTAAACCCATCATTGATCACGCCA-BHQ-3’，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是CY5，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ；4）NMV-正向引物：10μmol/L，引物序列为5’-CCATCAAACCCTGCGATCA-3’；5）NMV-反向引物：10μmol/L，引物序列为5’-CAGACCACCTTGGCGAAGTAC-3’；6）NMV-荧光探针：10μmol/L，荧光探针序列为5’-FAM-TCACTCCGCGCCAGTTCTGCA-BHQ-3’，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ；7）随机引物：100μmol/L；8）RTBuffer：5×；9）RNA酶抑制因子：40U/μL；10）反转录酶：200U/μL；11）dNTPs：10mmol/L；12）TaqManPCRMasterMix：2×；13）水仙黄条病毒、水仙花叶病毒的阳性对照样品；14）不含水仙黄条病毒、水仙花叶病毒的阴性对照样品；15）RNase-freeddH2O。（二）利用上述水仙黄条病毒和水仙花叶病毒多重荧光定量RT-PCR试剂盒的检测方法，包括以下步骤：1）反转录反应：在PCR管中加入待测样品总RNA3μL、浓度为100μmol/L的随机引物1μL和RNase-freeddH2O7μL，70℃水浴10min，迅速冰浴5min，再加入下列试剂：5×RTBuffer5μL、浓度为10mmol/LdNTPs2μL、浓度为200U/μL反转录酶1μL、浓度为40U/μLRNA酶抑制因子1μL，42℃水浴60min，70℃水浴10min后冷却至室温，合成cDNA；2）荧光定量PCR反应：取步骤1）合成的cDNA3μL，按每管加浓度为10μmol/LNMV-正向引物1µL、浓度为10μmol/LNMV-反向引物1µL、浓度为10μmol/LNMV-荧光探针0.75μL、浓度为10μmol/LNYSV-正向引物1µL、浓度为10μmol/LNYSV-反向引物1µL、浓度为10μmol/LNYSV-荧光探针0.75μL、2×TaqManPCRMasterMix12.5µL、ddH2O4μL，使反应总体积为25μL；混合后的反应液，95℃30s，然后95℃15s、60℃1min，共进行40个循环，反应结束。本专利技术根据水仙黄条病毒和水仙花叶病毒基因的保守序列设计特异性引物和荧光探针，建立了用于水仙黄条病毒和水仙花叶病毒快速检测的多重荧光定量RT-PCR方法。较之已有技术而言，本专利技术所提供的水仙黄条病毒和水仙花叶病毒多重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其检测方法有益效果在于：1）特异性强：特异性引物和荧光探针在PCR过程中可以实现对靶基因的双重控制，不仅能够实现水仙黄条病毒、水仙花叶病毒单一或复合侵染的检测，还能够将水仙黄条病毒、水仙花叶病毒与其他非特异性病毒准确区分；2）灵敏度高：与血清学ELISA、普通RT-PCR检测方法相比，荧光定量RT-PCR具有更高的灵敏度；3）节约样品、缩短检测周期：由于多重荧光定量RT-PCR可以检测同一个样品上是水仙黄条病毒、水仙花叶病毒单个病毒侵染，还是两个病毒同时侵染，因此一次检测可以同时检测两个病毒，既节约了检测样品，也缩短了检测周期，避免了之前检测两种病毒需要开展两次普通RT-PCR的缺点；4）操作简本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水仙黄条病毒和水仙花叶病毒多重荧光定量RT‑PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：1）NYSV‑正向引物：10μmol/L，引物序列为5’‑TGGATGGAGAAGAACAAGTTGAATT‑3’；2）NYSV‑反向引物：10μmol/L，引物序列为5’‑GCCATTATCTGCCTGAGTGTAGGT‑3’；3）NYSV‑荧光探针：10μmol/L，荧光探针序列为5’‑CY5‑CCACTTAAACCCATCATTGATCACGCCA‑BHQ‑3’，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是CY5，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ；4）NMV‑正向引物：10μmol/L，引物序列为5’‑CCATCAAACCCTGCGATCA‑3’；5）NMV‑反向引物：10μmol/L，引物序列为5’‑CAGACCACCTTGGCGAAGTAC‑3’；6）NMV‑荧光探针：10μmol/L，荧光探针序列为5’‑FAM‑TCACTCCGCGCCAGTTCTGCA‑BHQ‑3’，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ；7）随机引物：100μmol/L；8）RT Buffer：5×；9）RNA酶抑制因子：40U/μL；10）反转录酶：200U/μL；11）dNTPs：10mmol/L；12）TaqMan PCR Master Mix：2×；13）水仙黄条病毒、水仙花叶病毒的阳性对照样品；14）不含水仙黄条病毒、水仙花叶病毒的阴性对照样品；15）RNase‑free ddH...

【技术特征摘要】
1.一种水仙黄条病毒和水仙花叶病毒多重荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：1）NYSV-正向引物：10μmol/L，引物序列为5’-TGGATGGAGAAGAACAAGTTGAATT-3’；2）NYSV-反向引物：10μmol/L，引物序列为5’-GCCATTATCTGCCTGAGTGTAGGT-3’；3）NYSV-荧光探针：10μmol/L，荧光探针序列为5’-CY5-CCACTTAAACCCATCATTGATCACGCCA-BHQ-3’，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是CY5，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ；4）NMV-正向引物：10μmol/L，引物序列为5’-CCATCAAACCCTGCGATCA-3’；5）NMV-反向引物：10μmol/L，引物序列为5’-CAGACCACCTTGGCGAAGTAC-3’；6）NMV-荧光探针：10μmol/L，荧光探针序列为5’-FAM-TCACTCCGCGCCAGTTCTGCA-BHQ-3’，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ；7）随机引物：100μmol/L；8）RTBuffer：5×；9）RNA酶抑制因子：40U/μL；10）反转录酶：200U/μL；11）dNTPs：10mmol/L；12）TaqManPCRMasterMix：2×；13）水仙黄条病毒、水...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈建国，高芳銮，王宇，金玲，吴祖建，
申请(专利权)人：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：福建,35