受激辐射损耗显微方法及显微装置制造方法及图纸

本发明专利技术提供的受激辐射损耗显微方法及装置，包括如下步骤：步骤S1，将初始激光光束分为第一激光光束和第二激光光束；步骤S2，调节所述第一激光光束的能量，并将所述第一激光光速聚焦在晶体光纤上，所述晶体光纤能够被激光激发,输出具有连续光谱的激发光；步骤S3，调制所述激发光为红色光斑，调制所述第二激光光束为环形的STED光；步骤S4，将所述激发光和所述STED光重叠为同轴光线，并聚焦于荧光样品上；步骤S5,通过调节所述第一激光光束的能量，使荧光样品发出荧光；步骤S6，采集荧光样品发出的荧光，获得图像。本发明专利技术提供受激辐射损耗显微方法及显微装置，分辨率高，能够连续调节激发光和STED光的波长，适应不同的荧光。

【技术实现步骤摘要】
受激辐射损耗显微方法及显微装置
本专利技术涉及显微成像，特别涉及一种受激辐射损耗显微方法及显微装置。
技术介绍
光学显微镜在生物学领域起着举足轻重的作用，但是由于光的衍射效应，光学成像系统都有一个分辨率极限。1873年,德国物理学家ErnstAbbe提出远场光学显微镜的横向分辨率极限的数值约为λ/2NA,其中λ是光波波长,NA为透镜数值孔径且小于1，因此在可见光波段内，远场光学显微镜分辨率极限仅有200纳米。由于细胞的细微结构，调节细胞增殖﹑分化﹑凋亡以及信号传递等体系的特征尺度都在纳米量级，所以光学显微镜分辨率的提高就成为一个亟需解决的难题。美国专利公开的专利号为US5731588的受激辐射损耗显微镜(STED)是第一个突破衍射限制的超分辨显微镜，在2006年被Science杂志评选为科学界十大突破之一，其基本原理是使用两束激光，第一束脉冲激发光将荧光材料从基态S0激发到第一单重激发态较高振动能级S1*，电子会快速弛豫到激发态最低振动能级S1，与此同时，使用另一束波长较长的激光(通常位于发光材料发射光谱的红外末端)，称为退激光或STED光，将处于S1态的电子以受激发射损耗方式退激发至基态，并发出一个与STED光波长相同的光子。由于STED光是经过相位调制的中心为零点的甜面包圈形状光斑，因此STED光中心没有退激发效果，通过重叠激发光与退激发光斑，只允许位于STED零点的激发光激发的荧光物质发光，从而提高分辨率。目前，受激发射损耗显微镜应用于生物医学领域所达到的分辨率约为50纳米。通常，受激辐射损耗显微镜的激发光源需要使用皮秒脉冲激光，而STED光则可选用高能量的脉冲激光或连续激光光源。但是，由于各种发光材料的吸收及发射波长差别很大，因此为了能适用于尽可能多的发光材料，理想的受激发射损耗显微镜需要能连续调节激发光和STED光的波长。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术提供一种高分辨率的受激辐射损耗显微方法及显微装置，能够连续调节STED光的波长。第一方面，本专利技术提供的受激辐射损耗显微方法，包括如下步骤：步骤S1，将初始激光光束分为第一激光光束和第二激光光束；步骤S2，调节所述第一激光光束的能量，并将所述第一激光光速聚焦在晶体光纤上，所述晶体光纤能够被激光激发,输出具有连续光谱的激发光；步骤S3，调制所述激发光为红色光斑，调制所述第二激光光束为环形的STED光；步骤S4，将所述激发光和所述STED光重叠为同轴光线，并聚焦于荧光样品上；步骤S5,通过调节所述第一激光光束的能量，使荧光样品发出荧光；步骤S6，采集荧光样品发出的荧光，获得图像。进一步地，步骤S1中，所述初始激光光束通过飞秒激光器获得；并使所述初始激光光束透过偏振分光棱镜，从而获得相互垂直的所述第一激光光束和所述第二激光光束。进一步地，步骤S2中，先将所述第一激光光束的能量降到预设值以下，再将所述第一激光光速聚焦在晶体光纤上，使晶体光纤发出的激发光透过起偏镜，所述晶体光纤的偏振方向与所述起偏镜的方向一致。本专利技术提供的受激辐射损耗显微方法，将初始激光光束分成第一激光光束和第二激光光束，第二激光光束作为STED光源，第一激光光束用来激发晶体光纤，得到能够连续调节光谱的激发光。然后将激发光和STED光重叠后聚焦到待测样品上，采集产生的荧光获得成像。本专利技术使用的晶体光纤可被激光激发，改变激光的波长，即改变STED光的波长，但并不会对激发光造成太大影响。而且由于STED光和激发光都来源于初始激光光束，因此他们的脉冲频率从本质上是同步的，无需使用额外的电子元器件。进入晶体光纤的激光能量会影响激发光的光谱范围，通过调节第一激光束的激光能量，获得具有超连续光谱的激发光，能够使多种荧光样品发光。因此，本专利技术提供受激辐射损耗显微方法，能够连续调节激发光和STED光的波长，从而适用于多种荧光材料。第二方面，本专利技术提供的受激辐射损耗显微装置，包括：飞秒激光器、偏振分光棱镜、晶体光纤和荧光探测器，飞秒激光器发出的激光透过所述偏振分光棱镜后分为第一激光光束和第二激光光束，所述第一激光光束进入第一光路，所述第二激光光束进入第二光路，所述晶体光纤设在所述第一光路中；所述第一激光光路中设有位于所述晶体光纤之前的第二半波片和第一凸透镜；所述第二光路中设有第三凸透镜和相位板；所述第一激光光束依次透过第二半波片和第一凸透镜后，进入所述晶体光纤，激发所述晶体光纤输出激发光；所述第二半波片用于使所述第一激光光束与所述晶体光纤的偏振性一致，所述第一凸透镜用于将所述第一激光光束聚焦在晶体光纤上；所述第二激光光束依次透过所述第三凸透镜和所述相位板后，形成环形的STED光；所述第三凸透镜用于对所述第二激光光束扩束；所述激发光和所述STED光经反光镜重叠为同轴光线后进入第三光路，所述第三光路的末端设有载物台；所述荧光探测器用于经第四光路探测位于载物台上荧光样品发出的荧光。进一步地，所述第一光路和/或所述第二光路中还设有光程调节器。进一步地，所述飞秒激光器和所述偏振分光镜之间设有第一半波片。进一步地，所述第一光路中，位于所述晶体光纤后方，还依次设有第二凸透镜、第一起偏镜和第三半波片。进一步地，所述第二光路中设有脉冲拉宽装置，所述脉冲拉宽装置设于所述相位板的前方。进一步地，所述第二光路中还设有位于所述相位板前方的第二起偏镜。进一步地，所述第一光路和第四光路中均设有滤镜。本专利技术提供的受激辐射损耗显微装置，包括：飞秒激光器、偏振分光棱镜、晶体光纤和荧光探测器。飞秒激光器发出的激光透过所述偏振分光棱镜后分为第一激光光束和第二激光光束。所述晶体光纤能够被激光激发，改变飞秒激光器发出的激光的波长，即改变STED光的波长，但并不会对激发光造成太大影响。而且由于STED光和激发光都来源于初始的激光光束，因此他们的脉冲频率从本质上是同步的，无需使用额外的电子元器件。进入晶体光纤的激光能量会影响激发光的光谱范围，通过调节第一激光束的激光能量，获得具有超连续光谱的激发光，能够使多种荧光样品发光。因此，本专利技术提供的受激辐射损耗显微装置，能够连续调节激发光和STED光的波长，从而适用于多种荧光材料。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。图1为实施例一提供的受激辐射损耗显微方法的原理示意图；图2为实施例二提供的受激辐射损耗显微装置的原理示意图；图3为本专利技术中晶体光纤在不同能量和不同波长激发下的发射光谱图；图4为实施例二提供的受激辐射损耗显微装置的成像示意图；图5为实施例三提供的受激辐射损耗显微装置的原理示意图。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本专利技术所属领域技术人员所理解的通常意义。参照图1，实施例一中，本专利技术提供的受激辐射损耗显微方法，包括如下步骤：步骤S1，将初始激光光束分为第一激光光束和第二激光光束；掺钛蓝宝石激光的能量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种受激辐射损耗显微方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1，将初始激光光束分为第一激光光束和第二激光光束；步骤S2，调节所述第一激光光束的能量，并将所述第一激光光速聚焦在晶体光纤上，所述晶体光纤能够被激光激发,输出具有连续光谱的激发光；步骤S3，调制所述激发光为红色光斑，调制所述第二激光光束为环形的STED光；步骤S4，将所述激发光和所述STED光重叠为同轴光线，并聚焦于荧光样品上；步骤S5,通过调节所述第一激光光束的能量,使荧光样品发出荧光；步骤S6，采集荧光样品发出的荧光，获得图像。

【技术特征摘要】
1.一种受激辐射损耗显微方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1，将初始激光光束分为第一激光光束和第二激光光束；步骤S2，调节所述第一激光光束的能量，并将所述第一激光光速聚焦在晶体光纤上，所述晶体光纤能够被激光激发,输出具有连续光谱的激发光；步骤S3，调制所述激发光为红色光斑，调制所述第二激光光束为环形的STED光；步骤S4，将所述激发光和所述STED光重叠为同轴光线，并聚焦于荧光样品上；步骤S5,通过调节所述第一激光光束的能量,使荧光样品发出荧光；步骤S6，采集荧光样品发出的荧光，获得图像。2.根据权利要求1所述的受激辐射损耗显微方法，其特征在于，步骤S1中，所述初始激光光束通过飞秒激光器获得；并使所述初始激光光束透过偏振分光棱镜，从而获得相互垂直的所述第一激光光束和所述第二激光光束。3.根据权利要求1所述的受激辐射损耗显微方法，其特征在于，步骤S2中，先将所述第一激光光束的能量降到预设值以下，再将所述第一激光光速聚焦在晶体光纤上，使晶体光纤发出的激发光透过起偏镜，所述晶体光纤的偏振方向与所述起偏镜的方向一致。4.一种受激辐射损耗显微装置，其特征在于，包括：飞秒激光器、偏振分光棱镜、晶体光纤和荧光探测器，飞秒激光器发出的激光透过所述偏振分光棱镜后分为第一激光光束和第二激光光束，所述第一激光光束进入第一光路，所述第二激光光束进入第二光路，所述晶体光纤设在所述第一光路中；所述第一激光光路中设有位于所述晶体光纤之前的第二半...

【专利技术属性】
技术研发人员：王富，张辉，乔丙闪，张晓蕾，
申请(专利权)人：王富，
类型：发明
国别省市：浙江,33