利用水凝胶微笼捕获蛋白质的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用水凝胶微笼捕获蛋白的方法，其包括（1）使超支化聚丙三醇水溶液、双巯基聚乙二醇水溶液、带有标记的待捕获蛋白肽单体溶液在微流控芯片上混合得到混合液，然后使混合液、油相物质在微流控芯片上混合，获得微液滴，微液滴内，超支化聚丙三醇和双巯基聚乙二醇发生巯基‑烯的点击化学反应形成水凝胶，得到微凝胶；（2）对微凝胶进行培养使其中的蛋白肽单体发生折叠聚集；（3）加入脱乳化剂以破坏微凝胶的油相外层并进行清洗。本发明专利技术可仅捕获错误折叠程度高的蛋白质寡聚物和纤维，从而进行针对性研究。同时，水凝胶的形成无需借助加热或紫外照射，在此过程中不会对蛋白质结构产生影响，使检测结果更准确。

【技术实现步骤摘要】
利用水凝胶微笼捕获蛋白质的方法
本专利技术涉及一种与神经退行性疾病产生有关的蛋白质例如β-淀粉样蛋白、tau蛋白、a-突触核蛋白等的捕获方法。该捕获方法可为准确分析和研究蛋白质的聚集情况从而为进一步开发这些疾病的治疗药物提供必要的条件。
技术介绍
世界人口在不断的老龄化，据世界卫生组织统计，目前全球有3560万痴呆患者，到2030年这一数字将增加一倍，2050年这一数字将增加至三倍以上。痴呆类型包括阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病等神经退行性疾病。普遍认为大量错误折叠的蛋白质，如β-淀粉样蛋白(amyloidbeta)、tau蛋白、a-突触核蛋白(α-synuclein)在细胞内聚集是神经退行性疾病产生的物质基础。因此在开发针对这些疾病的治疗药物的过程中，需要有一种简单易用的方法捕获这些蛋白，并实时监控这些物质对于蛋白质聚集的影响。水凝胶是由交联的聚合物链形成的三维聚合物空间网状结构。它不溶于水但亲水性使其能够容纳大量的水。此外，可以通过调节聚合物浓度和前体的分子量来改变孔径。其内部多孔结构可以将药物分子包裹在聚合物网络内。此外，这种结构也可以作为细胞封装的支架：其纳米级孔径可以允许后续向细胞供应营养物，但同时防止较大物质如抗体或酶的渗透。此外，水凝胶的生物相容性使其能更好地模拟蛋白质折叠的自然环境。水凝胶通常分为物理凝胶和化学凝胶两种。其中物理凝胶包括热可逆凝胶，其在常温下呈稳定的凝胶态，但加热后可转变为溶液。但是，其中温度的改变可能影响蛋白质反应速度，破坏蛋白质结构。而化学凝胶使用较多的包括含有甲基丙烯酸酯或丙烯酸酯基团的超支化聚丙三醇(hPG)和聚乙二醇(PEG)。通过将这些大分子单体与光引发剂一同暴露于紫外线下进行快速交联，或利用加热手段引发自由基进行聚合。综上，无论是利用加热或紫外线辐照的方法，均会影响蛋白质反应，从而使得检测结果不准确。此外，现有常规的物理凝胶和化学凝胶捕获方法捕获的不仅有错误折叠程度高的蛋白质寡聚物和纤维，也会捕获错误折叠程度低的小分子蛋白质和部分小尺寸单体，无法对错误折叠程度高的蛋白质寡聚物和纤维进行针对性研究。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的蛋白质捕获方法，该方法对错误折叠程度高的蛋白质寡聚物和纤维可进行针对性捕获，同时，该方法无需依赖加热或紫外线辐照从而可以避免对蛋白质反应造成影响，从而可以获得更准确的分析结果。为解决以上技术问题，本专利技术采取的技术方案如下：一种利用水凝胶微笼捕获蛋白的方法，其包括如下步骤：(1)使超支化聚丙三醇水溶液、双巯基聚乙二醇水溶液、带有标记的待捕获蛋白肽单体溶液在微流控芯片上混合得到混合液，然后使所述混合液、油相物质在所述微流控芯片上混合，获得微液滴，所述微液滴内，所述超支化聚丙三醇和双巯基聚乙二醇发生巯基-烯的点击化学反应形成水凝胶，得到外层为油相内层为含有蛋白肽溶液的微凝胶；(2)对所述微凝胶进行培养使其中的蛋白肽单体发生折叠聚集，得到外层为油相内层含有不同折叠程度的聚合蛋白的微凝胶；(3)向经过步骤(2)的体系中加入脱乳化剂以破坏所述油相外层并进行清洗以除去所述微凝胶内小于所述微凝胶孔道的聚合蛋白或未聚合蛋白，即得捕获了蛋白的水凝胶微笼，所述捕获了蛋白的水凝胶微笼可用于后续的检测分析。进一步地，步骤(1)中，所述微流控芯片包括芯片本体，形成于芯片本体上且在一端部相交汇构成第一聚焦区的第一微通道、第二微通道和第三微通道，形成于芯片本体上且在一端部相交汇构成第二聚焦区的第四微通道、第五微通道和第六微通道，以及形成于芯片本体上的第七微通道，其中所述第四微通道的另一端与所述第一聚焦区连通，所述第七微通道的一端与所述第二聚焦区连通，将超支化聚丙三醇水溶液、双巯基聚乙二醇水溶液、带有标记的待捕获蛋白肽溶液分别注入所述第一微通道、第二微通道和第三微通道，三者在第一聚焦区混合得到所述混合液，分别向第五微通道和第六微通道内注入所述油相物质，混合液经第四微通道流到第二聚焦区，在二聚焦区与从第五微通道和第六微通道内注入的油相物质混合形成所述微液滴。进一步地，在各所述微通道的进液端设置过滤器(过滤精度为例如约1微米)，以防止可能存在的颗粒物质造成通道堵塞。进一步地，所述方法还包括以软刻蚀法制作微流控芯片的步骤，该步骤包括如下几步：i)将设计好的第一微通道、第二微通道、第三微通道、第四微通道、第五微通道以及第六微通道印刷在醋酸膜上，并将醋酸膜放置于涂覆有光刻胶的硅晶片顶部，经过紫外光照射，得到芯片模板；ii)将聚二甲基硅氧烷预聚物和其交联剂灌注在所述芯片模板上，进行固化，将固化的聚二甲基硅氧烷模具剥离芯片模板，并对各所述微通道的出入口进行压力穿孔，之后运用表面平整的基底对各微通道进行密封；iii)将表面疏水剂注入各微孔通道并静置，使得微通道表面疏水即得所述微流控芯片。进一步地，步骤(1)中，所述带有标记的待捕获蛋白肽单体溶液可通过先采用有机荧光素对蛋白肽单体侧链的N-末端进行荧光标记，然后溶解于0.5％～2％的氨水中制备预备蛋白肽单体溶液，最后以pH7-8的缓冲液稀释成设定浓度得到。根据本专利技术，上述有机荧光色素包括但不限于AlexaFluor405、Alexa-350、AMCA-X、Alexa-488、FITC、HiLyteFlour488、Alexa-430、Alexa-555、HiLytePlus555、DyLight549、HiLyteFluor555、AlexaFluor546、Alexa-546、Alexa-568、AlexaFlour594、HiLyteFluorTR(622)、Alexa-633等。进一步地，步骤(1)中，所述双巯基聚乙二醇水溶液通过将2-亚氨基硫烷盐酸盐与聚乙二醇双胺在pH为7-8的缓冲溶液中反应得到。进一步地，步骤(1)中，所述蛋白肽单体为人β淀粉样蛋白1-40，人β淀粉样蛋白1-42，tau蛋白或a-突触核蛋白。进一步地，步骤(1)中，所述油相物质优选为选自氟化液、矿物类油、植物油及脂肪酸中的一种或多种的组合。优选地，步骤(1)中，所述超支化聚丙三醇和双巯基聚乙二醇水溶液的流速分别为10-400微升/小时、所述带有标记的待捕获蛋白肽单体溶液的流速为10-400微升/小时，所述油相的流速为400-4000微升/小时，所述微液滴生产速度为0.2-10千赫兹。进一步优选地，步骤(1)中，所述超支化聚丙三醇和双巯基聚乙二醇水溶液的流速分别为180-220微升/小时、所述带有标记的待捕获蛋白肽单体溶液的流速为180-220微升/小时，所述油相的流速为1800-2200微升/小时。根据本专利技术的一个具体且优选方面，所述脱乳化剂为全氟辛醇油，所述清洗采用pH7-8的磷酸缓冲溶液，在离心旋杯柱中进行清洗。根据本专利技术，聚乙二醇双胺、超支化聚丙三醇的分子量可根据需要的微笼孔径来设计。优选地，所述聚乙二醇双胺的分子量为1-5kDa，超支化聚丙三醇的分子量为10-30kDa。更优选地，所述聚乙二醇双胺的分子量为2-3kDa，超支化聚丙三醇的分子量为15-25kDa。根据本专利技术，所述微凝胶的大小约为30-80微米，优选为40-60为微米，更优选为45-55微米。由于以上技术方案的实施，本专利技术与现有技本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用水凝胶微笼捕获蛋白的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)使超支化聚丙三醇水溶液、双巯基聚乙二醇水溶液、带有标记的待捕获蛋白肽单体溶液在微流控芯片上混合得到混合液，然后使所述混合液、油相物质在所述微流控芯片上混合，获得微液滴，所述微液滴内，所述超支化聚丙三醇和双巯基聚乙二醇发生巯基‑烯的点击化学反应形成水凝胶，得到外层为油相内层为含有蛋白肽溶液的微凝胶；(2)对所述微凝胶进行培养使其中的蛋白肽单体发生折叠聚集，得到外层为油相内层含有不同折叠程度的聚合蛋白的微凝胶；(3)向经过步骤(2)的体系中加入脱乳化剂以破坏所述油相外层并进行清洗以除去所述微凝胶内小于所述微凝胶孔道的聚合蛋白或未聚合蛋白，即得捕获了蛋白的水凝胶微笼，所述捕获了蛋白的水凝胶微笼可用于后续的检测分析。

【技术特征摘要】
1.一种利用水凝胶微笼捕获蛋白的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)使超支化聚丙三醇水溶液、双巯基聚乙二醇水溶液、带有标记的待捕获蛋白肽单体溶液在微流控芯片上混合得到混合液，然后使所述混合液、油相物质在所述微流控芯片上混合，获得微液滴，所述微液滴内，所述超支化聚丙三醇和双巯基聚乙二醇发生巯基-烯的点击化学反应形成水凝胶，得到外层为油相内层为含有蛋白肽溶液的微凝胶；(2)对所述微凝胶进行培养使其中的蛋白肽单体发生折叠聚集，得到外层为油相内层含有不同折叠程度的聚合蛋白的微凝胶；(3)向经过步骤(2)的体系中加入脱乳化剂以破坏所述油相外层并进行清洗以除去所述微凝胶内小于所述微凝胶孔道的聚合蛋白或未聚合蛋白，即得捕获了蛋白的水凝胶微笼，所述捕获了蛋白的水凝胶微笼可用于后续的检测分析。2.根据权利要求1所述的利用水凝胶微笼捕获蛋白的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述微流控芯片包括芯片本体，形成于所述芯片本体上且在一端部相交汇构成第一聚焦区的第一微通道、第二微通道和第三微通道，形成于所述芯片本体上且在一端部相交汇构成第二聚焦区的第四微通道、第五微通道和第六微通道，以及形成于芯片本体上的第七微通道，其中所述第四微通道的另一端与所述第一聚焦区连通，所述第七微通道的一端与所述第二聚焦区连通，将超支化聚丙三醇水溶液、双巯基聚乙二醇水溶液、带有标记的待捕获蛋白肽溶液分别注入所述第一微通道、第二微通道和第三微通道，三者在所述第一聚焦区混合得到所述混合液，分别向所述第五微通道和第六微通道内注入所述油相物质，混合液经第四微通道流到第二聚焦区，在二聚焦区与从第五微通道和第六微通道内注入的油相物质混合形成所述微液滴。3.根据权利要求2所述的利用水凝胶微笼捕获蛋白的方法，其特征在于：所述方法还包括以软刻蚀法制作所述微流控芯片的步骤，该步骤包括如下几步：i)将设计好的第一微通道、第二微通道、第三微通道、第四微通道、第五微通道以及第六微通道印刷在醋酸膜上，并将醋酸膜放置于涂覆有光刻胶的硅晶片顶部，经过紫外光照射，得到芯片模板；ii)将聚二甲基硅氧烷预聚物和其...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜菁，杨洋，
申请(专利权)人：苏州博福生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32