一种蛋白质分子印迹水凝胶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种蛋白质分子印迹水凝胶的制备方法。该方法包括如下步骤：将质量百分比浓度为２．０～８．０％的羧甲基淀粉－对氨基苯酚接枝物水溶液与质量百分比浓度为０．０２～０．２０％牛血清蛋白水溶液混合，搅拌条件下，依次加入过氧化氢与辣根过氧化酶，８～１２秒内发生凝胶化，经洗脱除去模板分子牛血清蛋白，即得到对牛血清蛋白具有选择性吸附特性的分子印迹水凝胶。本发明专利技术具有原料易得、快速凝胶化、反应温和、易控制、获得的分子印迹水凝胶具有较好的识别性能及优良的生物降解和生物相容性，可望在蛋白质分离得到应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于功能高分子水凝胶材料的
，特别涉及一种酶促凝胶 化快速形成蛋白质分子印迹水凝胶的制备方法。
技术介绍
分子印迹技术是通过模板分子在聚合物网络中形成特征识别单元的过程。近年来，基于分子印迹技术制备出的分子印迹水凝胶(MIHs)材料， 不仅可发挥水凝胶柔韧性好、传质快的特性，而且可提高聚合物网络对特定 分子的结合力。目前，该类功能材料已在分离、传感、催化、抗体模拟、药 物传输等领域显示出广阔的应用前景。蛋白质是一类重要的天然有机物。它是生物体内一切组织的基础物质， 并在生命现象和生命过程中起决定性作用。蛋白质的结构复杂， 一般由200 300个氨基酸所构成的，这给蛋白质分离、提纯带来极大困难。目前，用于 蛋白质分离的方法主要有凝胶过滤、电泳和色谱法。然而，这些方法所需材 料的制备耗时长、成本高、且稳定性较差(Bergmarm N M, Peppas N A. Progress in Polymer Science, 2008, 33: 271-288)。利用分子印迹水 疑胶易于 大量制备、性能稳定、专一识别性等优点，可望解决蛋白质识别、分离中的 技术难题。迄今为止，有关氨基酸等小分子的分子印迹技术已得到一定程度的应 用，但对蛋白类生物大分子的印迹技术尚存在以下不足首先，常用分子印 迹材料制备过程中，为了实现分子识别，功能单体需先与模板分子相互作用 形成某种可逆复合物，再加入引发剂和交联剂进行共聚交联，这一过程往往 需数小时才能完成(中国专利CA 1844174A)，从而使蛋白质活性难以保持； 其次，传统分子印迹过程多在有机溶剂中进行，且有关共聚交联一般需在光 照或加热等条件下进行，而这些条件又极易引起蛋白质变性失活；第三，常 见MIHs制备时多采用丙烯酸、丙烯酰胺等乙烯基衍生物作为功能单体，二 甲基丙烯酸乙二醇酯、A^V-亚甲基双丙烯酰胺等作为交联剂(Ohad K,Havazelet B P. Langmuir, 2007, 23: 6329-6335)，致使所得分子印迹材料的生 物降解及相容性较差，从而限制了MIHs在蛋白质分子印迹方面的应用。因 此，如何在温和反应条件下、快速制备出具有良好生物相容性的MIHs材料， 是当前蛋白质分子印迹
的一项重要研究课题。
技术实现思路
为了解决上述现有技术的不足之处，本专利技术的目的在于提供一种蛋白质 分子印迹水凝胶的制备方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现 一种蛋白质分子印迹水凝胶的制 备方法，其特征在于包括以下操作步骤(1) 将质量百分比浓度为2.0 8.0 %的羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物水溶液与质量百分比浓度为0.02 0.2 %牛血清蛋白水溶液混合；(2) 在搅拌的条件下，依次加入占羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物总质 量的0.30 0.70 %的过氧化氢(H202)和占羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物总 质量的0.01 0.04。/。的辣根过氧化酶(HRP)，凝胶化反应8 12s，得到凝胶 化反应产物；(3) 洗脱除去模板分子牛血清蛋白，得到对牛血清蛋白具有选择性吸 附特性的分子印迹水凝胶。步骤(1)所述羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物溶液和牛血清蛋白溶液的 质量比为1:1。步骤(1)所述羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物溶液是将羧甲基淀粉-对氨 基苯酚接枝物溶于水中或缓冲试剂中；所述牛血清蛋白溶液是将牛血清蛋白 溶于水中或缓冲试剂中。所述缓冲试剂是碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、 磷酸二氢钠或柠檬酸钠。步骤(1)所述羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物的合成方法，包括以下操 作步骤(a) 制备羧甲基淀粉将10.0 g可溶性淀粉溶于40 mL水中，并加入 20 mL异丙醇和8.0 g氢氧化钠，60 °C条件下搅拌，溶胀熟化1 h，加入25.0 g氯乙酸钠，反应4h后，用乙醇沉淀、洗涤，于40 50。C下真空干燥48h， 得到羧甲基淀粉；(b) 制备羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物取5.0g步骤(a)所得羧甲 基淀粉溶于60 mL 二甲基亚砜(DMSO)中，100 °C条件下搅拌溶胀1 h;冷却至室温，在搅拌条件下，加入0.3 1.0gA^ ,二环己基碳二亚胺(DCC)、 0.15 0.50 g7V-羟基琥珀酰亚胺(NHS)禾卩0.30 2.0 g的对氨基苯酚进行酰 胺化反应；在搅拌条件下反应24h后，过滤除去沉淀物，用乙醇沉淀，洗涤、 干燥后得到羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物。步骤(2)所述过氧化氢制成质量百分比浓度为0.5 2.0%的水溶液；所 述辣根过氧化酶制成质量体积浓度为0.30 1.0 mg/mL的水溶液，该辣根过 氧化酶的活性为200 250 U/mg。步骤(3)所述洗脱除去牛血清蛋白的方法为将步骤(2)所得凝胶化 反应产物用质量百分含量为2.0 8.0 %的十二垸基磺酸钠的乙酸/水混合溶 液洗涤至其在紫外278 nm处没有吸收。所述乙酸/水是体积比为1: 9 2: 8的乙酸和水的混合物。将步骤(3)所得蛋白质分子印迹水凝胶用水洗涤至中性，除去残余的 十二垸基磺酸钠和乙酸，冷冻干燥得蛋白质分子印迹干胶。上述方法所得蛋白质分子印迹水凝胶的选择性吸附特性测定方法为称 取两份质量为0.10 g的分子印迹干胶并浸入蒸馏水中充分溶胀，再分别置于 5.0mL浓度均为1.0mg/mL的牛血清蛋白和干酪素水溶液中，吸附4h后， 用紫外分光光度法测定吸附量(牛血清和干酪素的测定波长分别为278 nm 和288 nm)，并计算出分离因子(a)和印迹效率(^)。本专利技术的原理是以具有良好生物降解和生物相容性的天然多糖为基本 原材料，首先合成了羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物，再采用酶促凝胶化法 在水溶液中快速形成蛋白质分子印迹水凝胶；本专利技术通过控制羧甲基淀粉与 对氨基苯酚接枝物的取代度及其与牛血清蛋白的投料比，以过氧化氢和辣根 过氧化酶为催化剂，引发凝胶化反应，于室温条件下，制备系列可生物降解 且具有良好生物相容性的蛋白质印迹水凝胶。本专利技术与现有技术相比，具有如下优点和有益效果(l)酶促凝胶化法 制备蛋白质印迹水凝胶，不涉及其它化学交联剂与引发剂，制备工艺简单， 且容易控制；(2)反应条件温和，在室温下瞬时形成，凝胶化速度快，可有 效避免蛋白质变性；(3)凝胶化过程在水介质中进行；(4)分子印迹凝胶的 强度可通过羧甲基淀粉与对氨基苯酚接枝物的浓度及取代度进行调控；(5) 由本专利技术的方法制得的分子印迹水凝胶性能稳定，可长期保存；(6)所采用 的主要原料为淀粉，原料来源广泛，所形成的分子印迹水凝胶具有良好的生 物降解性及生物相容性。附图说明图1为本专利技术牛血清蛋白分子印迹干凝胶模板分子洗脱前与洗脱后的红 外光谱图。具体实施例方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施 方式不限于此。 实施例1(1) 制备羧甲基淀粉将10.0g可溶性淀粉溶于40mL水中，并加入 20mL异丙醇、8.0g氢氧化钠，60。C条件下磁力搅拌，溶胀熟化1 h，加入 25.0g氯乙酸钠，反应4h后，用乙醇沉淀、洗涤，于40 °C真空干燥48 h， 即得到羧甲基淀粉，采用酸碱滴定法测得该羧甲基淀粉的取代度为0.20;(2) 制备羧甲基淀粉-对氨基苯酚接枝物取5.0g羧甲基淀粉置于1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质分子印迹水凝胶的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：　（１）将质量百分比浓度为２．０～８．０％的羧甲基淀粉－对氨基苯酚接枝物溶液与质量百分比浓度为０．０２～０．２％牛血清蛋白溶液混合；　（２）在搅拌的条件下，依次加入 占羧甲基淀粉－对氨基苯酚接枝物总质量的０．３０～０．７０％的过氧化氢和占羧甲基淀粉－对氨基苯酚接枝物总质量的０．０１～０．０４％的辣根过氧化酶，反应８～１２ｓ，得到凝胶化反应产物；　（３）洗脱除去牛血清蛋白，得到蛋白质分子印迹水凝胶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王红飞，张黎明，唐春燕，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]