用辛酸钠作分离剂的低温白蛋白分级分离法制造技术

本发明专利技术涉及通过将辛酸钠在较低温度加至Ｃｏｈｎ组分Ⅱ＋Ⅲ或Ⅳ－１流出液中能制备浊度水平不高于５ＮＴＵ的高度稳定的源自血浆的治疗用白蛋白溶液的方法。辛酸钠起分离剂的作用将白蛋白与不想要的蛋白质分开。由于它往往是净化剂分子，白白蛋白通过用含辛酸钠的缓冲液透析滤过而选择性地被稳定，因而能确保白蛋白单体含量高且浊度低。选择性稳定作用所需的辛酸钠的量由白蛋白分子上可提供的结合位置的量来定。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总的来讲涉及源自血浆的治疗用蛋白质溶液的制备方法，具体来讲，本专利技术涉及由血清或血浆制备选择性稳定的动物或人血清白蛋白(HSA)、α-1蛋白酶抑制剂(α-1PI)和抗凝血酶III(AT III)。Cohn分级分离法最初发表是在1946年，在美国仍是加工血浆的一个基本方法，该方法在白蛋白的制备时利用乙醇、一定的温度、pH、蛋白质浓度、离子强度和时间以使不想要的蛋白质不溶解(Cohn等人，J.Am.Chem.Soc.68，459(1946))。T.Gerelough在Cohn分级分离过程中连续使用95％乙醇大大减少所需的生产用体积，因而降低了相应的生产成本。Gerelough法在美国也是一个血浆分级分离的认可的标准方法(美国专利2710294，2710293(1955))。在欧洲，H.Nitschamann和P.Kistler描述了加工白蛋白的更简单的方法，但所得到的产品不能满足当时美国一些机构施行的规定的指标(VoxSang.，5，272(1960))。在美国，自从Cohn等人1946年发表了Cohn分级分离法以来，血浆的分级分离法一直采用Cohn技术。因此，二十多年来，制造厂商对寻求替代的白蛋白分级分离技术既无兴趣，亦无必要(M.Steinbuch，Vox Sang.，23，92(1972))。此外，由于常规的分级分离技术能制得可成功地用巴氏灭菌法(在60℃加热10小时)使病毒失活的白蛋白，因此白蛋白的制造厂商在寻求替代的和改进的分级分离法方面无积极性并且非常谨慎。1972年，M.Steinbuch开发出除乙醇外能通过沉淀分离血浆蛋白质的几种试剂。Steinbuch用Cohn组分III作原料，研究了以前用于稳定白蛋白(M.Steinbuch，Vox Sang.2392-106，1972，Yu L.Hao，美国专利4,222,934,1980)随后将脂质包膜病毒灭活的辛酸的沉淀能力(Seng等人，U.S4939176，1990)。结果，科学家们后来开发出几种用于纯化IgG、IgA、α-1酸性糖蛋白和前白蛋白的技术，同时发现该沉淀反应高度依赖于温度和pH。在制备人免疫球蛋白时，辛酸通常被认为是在pH4.8时对大多数血浆蛋白质有效的沉淀剂，只要参数例如温度和离子强度是最适宜的(Steinbuch等人，Preparative Biochemistry，3(4)，363-373(1973))。于是Steinbuch等人描述了用辛酸从哺乳动物血清中分离IgG的方法，指出大批的无免疫性球蛋白沉淀最好在略带酸性的pH但不低于4.5的pH下获得(Steinbuch等人，Arch.Biochem.Biophys.，134，279-294(1969))。Habeeb等人用辛酸沉淀以获得不含凝聚物、血纤维蛋白溶酶和血纤维蛋白溶酶原、抗补体活性低且储存稳定的源自血浆的IgG。(Preparative Biochemistry，14(1)，1-17(1984))。IgA还能基于IgA的溶解性在辛酸存在下和pH4.8的条件下由Cohn组分III作为常规分级分离的副产物制得(Pejaudier等人，Vox Sang.23，165-175(1972))。此外，组分III还能用作制备富IgM血浆部分的原料。辛酸钠也已用于纯化白蛋白。按照这些方法，辛酸钠被加至生产用血浆中，并在该工业生产液流暴露于高温时保护白蛋白。温度过高不仅能使生产液流的球蛋白变性，而且常常产生污染物新抗原(Schneider等人，美国专利4,156,681(1979)；Institute Merieux，美国专利3992367)。Cohn组分III还用辛酸处理以沉淀有助于血浆铜转运的α球蛋白—血浆铜蓝蛋白。用这种技术制备血浆铜蓝蛋白能避免牵涉乙醇或丙酮的变性步骤，但该方法仅已用于马、骡、兔、山羊、绵羊和狒狒的血浆(M.Steinbuch，Vox Sang.，23，92-106(1972))。目前，各种技术和专利文献中包含无数加入辛酸钠作稳定剂的制备白蛋白的方法和涉及辛酸沉淀以由源自血浆的Cohn组分III获得免疫球蛋白的纯化技术。但是，我们尚未见到在制备白蛋白时用辛酸钠作分离剂(partitioning agent)以将白蛋白与不想要的球蛋白和生产废料分开的文献公开。我们还出乎意料地发现了用辛酸钠将白蛋白与不想要的物质分开而不使用乙醇沉淀剂来制备白蛋白的方法的显著的优点。第一，辛酸钠分离缩短了常规白蛋白制备方法的时间，这减少了产品处理环节，相应地将白蛋白的回收率提高25％或25％以上，所得到的白蛋白成品基本上不含铝并呈现出不低于97％的单体浓度。第二，辛酸钠分离显著减少了完成白蛋白制备所需的时间，因而将生产相关设备成本降低至少65％。第三，辛酸钠分离提高了由Cohn组分II＋III制备α-1PI和AT-III的收率，并且通常比制备血浆产品的常规方法能效率高。最后一点，也许是最重要的一点，辛酸钠分离显著减少了乙醇的使用，并且在白蛋白的制备过程中能完全避免使用丙酮，这就大大避免了有毒和对环境有害的溶剂残留物污染我们的环境。下面详细论述我们的专利技术。本专利技术提供用辛酸钠作分离剂制备基本上是单体的不含铝的白蛋白的方法。辛酸钠的使用在Cohn组分II＋III或组分IV-1流出液步骤中插入常规血浆分级分离。按照本专利技术，将辛酸钠加至包括期望的白蛋白和不期望的非白蛋白蛋白质和污染物的胶体流出液中。将温度和pH升高后，将混合物培养约6小时，使得辛酸钠起分离剂的作用而将该胶体溶液分成含白蛋白的上清液和含不想要的非白蛋白蛋白质(例如球蛋白)和生产废料的分散相。然后将辛酸钠处理过的悬浮液离心，并加入deae sephadex帮助过滤。接着将悬浮液过滤，超滤至12％蛋白质，用0.02M辛酸钠透析滤过，收集，并混合用于灭菌过滤。当该灭菌产品通过无菌检验时，将该白蛋白装入最终的容器中。附图说明图1是区分本专利技术和按照Cohn分级分离工艺的常规的白蛋白制备方法的流程图。该流程图仅着重指出了为区分本专利技术的简化的白蛋白制备法和费时的Cohn分级分离技术所必需的那些Cohn分级分离步骤。用于该在先技术方法的加工时间基于20厦普勒斯离心机，大多数其它的时间均基于1000升加工用血浆。术语的定义1.分离剂本文中所用的分离剂是指这样的物质，即当在制备白蛋白的过程中将其加至血浆蛋白质混合物中时能形成由两个分开的相组成的胶体悬浮液，所述两相为含白蛋白的上清液；和含附聚的蛋白质颗粒、包括α和β球蛋白的乳光分散相。2.沉淀剂本文中所用的沉淀剂是指这样的物质，即当在制备白蛋白的过程中将其加至血浆蛋白质混合物中时，若该溶液pH在特定范围之内则能可逆性地使溶液物质不溶。3.非白蛋白蛋白质本文中所用的非白蛋白蛋白质是指所有的非白蛋白蛋白质，主要是α、β和γ球蛋白以及酸性糖蛋白。4.生产废料本文中所用的生产废料是指非蛋白质污染物，主要包括多价金属离子例如铝，和生产用溶剂例如乙醇。5.含白蛋白的溶液本文所用的含白蛋白的溶液是指Cohn组分II＋III流出液或Cohn组分IV-1流出液。优选的实施方案材料1.本专利技术的原料Cohn组分-IV-1流出液按照常规Cohn血浆分级分离法制备，并得自由北卡罗来那Clayt本文档来自技高网...

【技术保护点】
由血浆蛋白质的混合物制备源自血浆的治疗用溶液的改进的方法，改进包括用辛酸钠作分离剂将白蛋白与非白蛋白蛋白质和污染物生产废料分开的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：RA田诺尔德，
申请(专利权)人：美国拜尔公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]