一种从乳清液中分离乳铁传递蛋白的方法技术

一种从乳清液中分离乳铁传递蛋白的方法，包括下列步骤：（１）采用一步磷酸钙亲和沉淀法将微量的乳铁传递蛋白选择性地从乳清液中预先沉淀分离，得含乳铁传递蛋白的沉淀粉；（２）沉淀粉用缓冲液或盐水抽提得含乳铁传递蛋白的抽提液；（３）抽提液用分子量截留值为５万道尔顿的超滤膜分离和浓缩，喷雾或冷冻干燥得含量为４０－５０％的乳铁传递蛋白粉产物；（４）浓缩液也可用阳离子交换柱作进一步纯化，再喷雾或冷冻干燥得含量为９０－９５％的乳铁传递蛋白粉产物。本发明专利技术方法具有低成本，低投资、管理容易，快速和完整的生产工艺，产品质量稳定等特点，是适用于大规模商业化生产高纯度乳铁传递蛋白的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及来自于动物的乳铁传递蛋白的获得方法，尤其是关于从乳清液中分离乳铁传递蛋白的方法。
技术介绍
铁传递蛋白族(Transferrins)是一组具有类似结构和性质的糖蛋白质。其类似性包括所有的铁传递蛋白的高级结构都由单链多肽形成两个相似但不均一铁结合部位(一分子蛋白质结合两分子Fe3+)以及含有多聚糖(Glycan)以及它们分子量大约在76000-81000道尔顿的范围内。铁传递蛋白广泛地分布在脊椎动物的生理液体和细胞中，例如乳汁、唾液、胆汁、胰液、眼泪和血浆等。血清铁传递蛋白(Serum Transferrin)、卵清铁传递蛋白(Ovatransferrin)和乳铁传递蛋白(Lactoferrin)是铁传递蛋白族的主要成员。铁传递蛋白最初被命名是因为其在铁代谢中的传递和储存功能。随着近二十年来对铁传递蛋白的广泛研究，已发现了该蛋白具有除了结合铁以外的多样化结合能力以及除了传递铁以外的多种生理或生物学功能。其中，人血清铁传递蛋白、人乳和牛乳传递蛋白的氨基酸顺序(一级结构)已确定。此外，乳铁传递蛋白的完整立体结构(高级结构)以及牛乳铁传递蛋白重要部份的立体结构也已确定。众所周知，用母(人)乳喂养的婴儿更健康。化学综合分析表明母(人)乳中各种活性物质的含量非常高，其中，人乳中的铁传递蛋白质是牛乳中的15倍。但商业的食用铁传递蛋白制剂则只能来自牛乳。由于牛乳铁传递蛋白残留在奶酪或干酪生产后的乳清废液中，所以从乳清液中提取和纯化这种蛋白质的技术也成为研究的焦点。近十几年来，世界各地的实验室对乳铁传递蛋白的功能，特别是生物功能进行了广泛的研究。使人感到迷惑不解的是该蛋白的生物学功能是如此之多样化。许多新的功能正不断地发现。表1归纳和罗列了那些该蛋白已被引例的生物学功能。表1乳铁传递蛋白的生物学功能 基于乳铁传递蛋白的生理和生物学功能，它的应用范围列于表2中。乳铁传递蛋白在保健品或功能食品范围内的应用前景非常光明。目前，乳铁传递蛋白主要用于婴儿食品，其次的使用范围将会是滋补品，化妆品(特别是防晒和处理青春痘)和饲料添加剂(例如，用于防猪腹泄)。表2乳铁传递蛋白预期的应用范围 有关乳铁传递蛋白的分离方法，常用的主要包含两大类方法即膜分离和色层分离技术。膜分离技术是当今广受重视和采用的一项新技术。根据膜孔径大小，分离技术又可分为微过滤(Microfiltration，0.1-10μm)、超过滤(Ultrafiltration，5-400nm)、毫微过滤(Nanofiltration，1-5nm)和反渗透(Reverseosmosis，0.1-1nm)。在食品和生物工程领域中，超过滤主要用于不同分子量蛋白质之间和蛋白质与其他小分子之间的分离。乳铁传递蛋白的分子量已知为8万道尔顿，所以用分子量截留值为5-8万道尔顿的超滤膜，或截留值为1万和5万道尔顿的超滤膜两次分离可以将乳清液中的乳铁传递蛋白与其他低分子量蛋白质、乳糖和无机盐分开。然而，膜分离技术的选择性较低，所以用该方法只能得到低纯度的蛋白制剂。如要制备高纯度的乳铁传递蛋白，就需使用色层分离。现阶段，可以有效地分离乳铁传递蛋白的色层分离技术是阳离子交换层析。由于乳铁传递蛋白的等电点为pH8.0左右，所以当把环境pH调到低于等电点时，蛋白质带正电而能吸附到阳离子交换剂上。阳离子交换剂的活性基团大多使用弱酸型，即羧甲基(-OCH2COO-)；也可使用强酸型活性基团像磺丙基(-CH2CH2CH2SO3-)，但羧甲基的分离效果更佳。离子交换剂的母体可以是交联葡聚糖凝胶或纤维素。用羧甲基交联葡聚糖凝胶树酯从牛奶乳清液中提取乳铁传递蛋白的得率为86％，分离的蛋白质纯度为95％。根据已发表的文献，可用于分离乳铁传递蛋白的层析分离技术包括铜螯合层析、凝胶层析、磷酸纤维素树酯。然而，由于乳铁传递蛋白在乳清中的含量很低(大约100-200毫克/升)，奶酪工厂日产乳清的量极大，一天数千吨属中等规模。所以用色层分离技术直接处理如此大的液量成本很高。此外，乳清是制造乳清浓缩蛋白和乳糖的原料，当乳清经过色层分离柱处理后，将不可避免地影响这些产品的生产。因此，一种低成本、低投资，快速和完整的生产工艺，用于大规模商业化生产高纯度乳铁传递蛋白的方法，是市场生产中期待已久待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术提供，该方法是使用一步磷酸钙亲和沉淀法将微量的乳铁传递蛋白选择性地从乳清液中预先沉淀分离。沉淀物用缓冲液或生理盐水进行抽提。抽提液或用分子量截留值为5万道尔顿的超滤膜分离和浓缩后喷雾或冷冻干燥，可以制备乳铁传递蛋白含量为40-50％的制剂，或将超滤浓缩液上离子交换柱进一步分离和纯化，然后喷雾或冷冻干燥可以制备乳铁传递蛋白含量达90-95％的制剂。本专利技术从乳清液中分离乳铁传递蛋白的工艺流程参见图1。本专利技术从乳清液中分离乳铁传递蛋白的方法，包括下列步骤1、采用一步磷酸钙亲和沉淀法将乳铁传递蛋白从乳清液中预先沉淀下来，沉淀物用离心机、板框压滤机、真空过滤机或其它过滤机械分离。即在1升乳清液中加入1-80毫摩尔氧化钙和1-10毫摩尔磷酸钠，用NaOH将pH调节至6.0-7.5，搅拌，过滤得含乳铁传递蛋白的磷酸钙沉淀泥，经喷雾或低温真空干燥或冷冻干燥得沉淀粉，低温-10℃储存备用。乳铁传递蛋白从乳清液转移至沉淀中的转移率可达70-75％；2、将沉淀粉或含乳铁传递蛋白的磷酸钙沉淀泥用缓冲液或盐水抽提，得含乳铁传递蛋白的抽提液，抽提率可达85-96％，缓冲液浓度0.1-1摩尔/升，盐水浓度0.5-5重量％，缓冲液或盐水的pH值为6-8，沉淀物与所述浓度的缓冲液或盐水用量的重量比为1∶5-10，抽提时间20-60分钟，缓冲液可选自磷酸盐、醋酸盐、硼酸盐缓冲液或它们的任意二种的混合物。3、含乳铁传递蛋白的抽提液用分子量截留值为5万道尔顿的超滤膜分离，浓缩得浓缩液，浓缩液可直接喷雾或冷冻干燥，制得含量为40-50％的乳铁传递蛋白粉产物。总产率为60-72％。4、浓缩液也可用阳离子交换柱进一步纯化，采用常用的羧甲基阳离子交换柱或交联葡聚糖凝胶树脂的离子交换柱。又因乳铁传递蛋白是碱性蛋白，在pH3.7时带较强的正电荷，需用离子强度较高的洗脱液洗脱。纯化后再喷雾或冷冻干燥，即制得含量为90-95％的乳铁传递蛋白粉产物。总产率为57-65％。有关钙与乳铁传递蛋白结合的研究已有文献报道(Y.Xu(2000)LactoferrinStructure，Function and Applications，(edited by Shimazaki，KI et al.)，p.47-52，Elsevier，Amsterdam，New York)。钙与乳铁传递蛋白结合显然是磷酸钙与乳铁传递蛋白共沉淀的基础，本专利技术方法中乳铁传递蛋白在pH调至6.0-7.5的情况下结合钙，然而钙与磷酸根形成磷酸钙，最终形成乳铁传递蛋白与磷酸钙的共沉淀。(见图2)。将本专利技术磷酸钙沉淀物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(见图3)，图3显示磷酸钙沉淀物含有一条与标准乳铁传递蛋白分子量相等的蛋白质谱带，通过对沉淀物的鉴定证实了沉淀物中是含有乳铁传递蛋白的。又将磷酸钙沉淀物电泳进行品红试剂的染色(见图4)，表明这条谱带是糖蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从乳清液中分离乳铁传递蛋白的方法，其特征在于该方法包括下列步骤： （１）采用一步磷酸钙亲和沉淀法将乳铁传递蛋白从乳清液中预先沉淀分离，即在１升乳清液中加入１－８０毫摩尔氯化钙和１－１０毫摩尔磷酸钠，调节ｐＨ为６．０－７．５，搅拌，过滤得含乳铁传递蛋白的磷酸钙沉淀泥，经喷雾或低温真空干燥或冷冻干燥得沉淀粉； （２）将沉淀粉用缓冲液或盐水抽提，得含乳铁传递蛋白的抽提液，缓冲液浓度为０．１－１摩尔／升，盐水浓度为０．５－５重量％，缓冲液或盐水的ｐＨ值为６－８，沉淀物与所述浓度的缓冲液或盐水用量的重量比为１∶５－１０，抽提时间为２０－６０分钟； （３）含乳铁传递蛋白的抽提液用分子量截留值为５万道尔顿的超滤膜分离，浓缩得浓缩液； （４）浓缩液用阳离子交换柱进一步纯化，再喷雾或冷冻干燥，制得含量为９０－９５％的乳铁传递蛋白粉。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐跃，
申请(专利权)人：徐跃，
类型：发明
国别省市：SG[新加坡]